氧瓶燃燒－離子色譜電導(dǎo)檢測法測定格列喹酮主環(huán)物中水合氯醛的含量

王東武，劉志娟，許 峰，劉 斐，侯倩倩，安冬華

(1．迪沙藥業(yè)集團 國家認定企業(yè)技術(shù)中心質(zhì)量研究院，山東 威海 264200;2．中國兵器工業(yè)集團 第五三研究所，山東 濟南 250031;3．迪沙藥業(yè)集團 迪素質(zhì)管部，山東 威海 264200)

格列喹酮屬于第二代磺脲類降糖藥，具有高活性胰島β細胞親和作用，能夠與胰島β細胞膜上的特異性受體結(jié)合，誘導(dǎo)產(chǎn)生適量胰島素以降低血糖濃度。該藥品安全有效，毒副作用少，對于新發(fā)的二型糖尿病有顯著療效，尤適用于糖尿病伴有腎損傷或腎移植的病人［1－4］。格列喹酮按照化學(xué)藥品注冊分類屬于6類化藥，其工業(yè)化大生產(chǎn)的工藝路徑是:格列喹酮主環(huán)物與對乙胺苯磺酰胺縮合后，再與N-環(huán)己基甲酰胺進行脫氫縮合生成格列喹酮(見圖1)。格列喹酮主環(huán)物作為合成格列喹酮的關(guān)鍵起始物料，按照國家食品藥品監(jiān)督管理局藥審中心頒布的《化學(xué)藥物雜質(zhì)研究的技術(shù)指導(dǎo)原則》要求，需對格列喹酮主環(huán)物進行雜質(zhì)研究。由格列喹酮主環(huán)物生產(chǎn)工藝可知，合成格列喹酮主環(huán)物過程中使用了大量的水合氯醛，由于水合氯醛具有一定的毒性，大劑量可引起昏迷、麻醉、肝損傷、呼吸抑制及心血管功能改變，甚至死亡，因此需要建立嚴格的質(zhì)量標準以控制格列喹酮主環(huán)物中水合氯醛的含量［5－9］。

圖1 格列喹酮的合成工藝路線圖Fig.1 Chart of gliquidone synthesis process

目前水合氯醛含量的測定方法主要為紫外分光光度法和氣相色譜法［10－12］，其中分光光度法易受格列喹酮主環(huán)物的干擾，而氣相色譜法檢測時，由于水合氯醛結(jié)構(gòu)中碳氫鍵數(shù)目較少，燃燒時產(chǎn)生的碳氫自由基少，導(dǎo)致靈敏度低，難以滿足準確檢測格列喹酮主環(huán)物中痕量水合氯醛的要求。

氧瓶燃燒法作為一種成熟的樣品前處理方法已廣泛應(yīng)用于有機溴、氯、磷及硫等元素的含量測定［13－15］，該方法使有機溴、氯、磷及硫等元素通過富氧燃燒轉(zhuǎn)化為無機元素，然后通過滴定、離子色譜等方法測定無機元素的含量間接測定這些有機元素。離子色譜法在離子檢測方面具有靈敏度高、專屬性好等優(yōu)點，特別是近年來離子色譜填料技術(shù)、電化學(xué)檢測技術(shù)及離子抑制技術(shù)的快速發(fā)展，使得離子色譜法在分析檢測領(lǐng)域得到了普遍應(yīng)用［16－21］。以氧瓶燃燒法進行樣品處理，離子色譜法進行檢測的分析方法，已廣泛應(yīng)用于化工、生物、醫(yī)藥等樣品中有機硫、氯等元素的含量測定［22－25］。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Toson IC－2010離子色譜儀(日本Toson公司)，配有高壓二元梯度泵、自動進樣器、柱溫箱、自動交換凝膠離子抑制系統(tǒng)、電導(dǎo)檢測器及IC－2010數(shù)據(jù)工作站;色譜柱:日本TSKgec SuperIC－Anion HS陰離子色譜柱(4.6 mm i.d.×10 cm，3.5 μm);TSK suppress IC－A陰離子抑制膠(日本Toson公司);熱電超純水系統(tǒng)EASY pureⅡ(美國熱電公司);濾紙(杭州特種紙業(yè)有限公司)。

Cl－，F(xiàn)－，I－，SO2－4，NO－2，NO－3，PO3－4，Br－對照品溶液，濃度均為1 000 mg/L(國防科技工業(yè)應(yīng)用化學(xué)一級計量站);NaOH(成都科龍化工試劑廠，批號20120416)、無水NaCO3(天津市鼎盛鑫化工有限公司，批號20141015)、NaHCO3(天津市巴斯夫化工有限公司，批號20081103)、水合氯醛(成都市科龍化工試劑廠，批號20110411)均為分析純;格列喹酮主環(huán)物(迪沙藥業(yè)集團原料藥研究二院，批號分別為:141205M1，141205M2，141205M3)。

1.2 溶液制備

供試品溶液:準確稱取格列喹酮主環(huán)物約10 mg，包裹于濾紙中，放入鉑絲鉗口，用酒精燈引燃，迅速置于盛有20 mL 0.05 mol/L NaOH的燃燒瓶中，瓶中富氧，燃盡后，以超純水封口，待吸收1 h后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，燒瓶多次沖洗，洗液均轉(zhuǎn)入容量瓶中，與吸收液合并，超純水定容至刻度后，搖勻。

供試品溶液加標:將上述洗液與吸收液合并后，加入一定體積的Cl－標準溶液，超純水定容至刻度，搖勻即得。

濾紙對照溶液:取濾紙(大小同包裹樣品用濾紙)，放入鉑絲鉗口，用酒精燈引燃，迅速置于盛有20 mL 0.05 mol/L NaOH的燃燒瓶中，進行富氧燃燒，燃盡后，超純水封口，待吸收1 h后，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，燒瓶多次沖洗，洗液均轉(zhuǎn)移至容量瓶中，與吸收液合并，超純水定容至刻度后，搖勻。

Cl－對照品儲備液:精密移取1 000 mg/L的Cl－標準溶液1 mL至100 mL容量瓶中，超純水稀釋后定容至刻度，搖勻即得。

Cl－對照溶液:精密量取Cl－對照品儲備液0.5 mL至100 mL容量瓶中，超純水稀釋后定容至刻度，搖勻即得。

干擾離子對照溶液:分別精密量取濃度均為1 000 mg/mL的F－，Cl－，NO－3，I－，PO3－4，SO2－4，Br－，NO－2標準溶液各1 mL至100 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度，搖勻，精密量取該溶液1 mL至25 mL容量瓶中，加超純水稀釋至刻度，搖勻即得。

本研究證實注射用雷貝拉唑鈉不僅對急性潰瘍，如醋酸性模型和幽門結(jié)扎法模型有效，還對消炎痛法模型等慢性潰瘍有效，同時還對大鼠反流性食管炎以及半胱胺型十二指腸潰瘍均具有良好的抑制作用，與臨床適用癥一致。

方法開發(fā)溶液的配制:精密稱取格列喹酮主環(huán)物約10 mg，用濾紙包裹，置于鉑絲鉗口，夾緊，引燃，迅速插入盛有20 mL 0.05 mol/L NaOH的富氧燒瓶中，燃盡后，超純水封口。待吸收1 h后，吸收液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，燒瓶多次沖洗，合并洗液與吸收液，加入0.4 mL 10 mg/L的Cl－，超純水定容后，搖勻即得。此時溶液中氯離子的濃度約為0.056 mg/mL。

加標供試品:精密稱取格列喹酮主環(huán)物約20 g加至50 mL二氯甲烷中，加入3種質(zhì)量(12.48，15.60，18.72 mg)的水合氯醛，攪拌至全溶，室溫真空抽干，得樣品。精密稱取該樣品約10 mg，用濾紙包裹，置于鉑絲鉗口，夾緊，引燃后，迅速插入盛有20 mL 0.05 mol/L NaOH水溶液中的500 mL富氧燒瓶中，密閉燒瓶后，倒置燒瓶待樣品熾灼燒盡后，超純水封口。1 h后，吸收液轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶中，燒瓶多次沖洗，合并洗液與吸收液，超純水定容，搖勻后即得加標80%供試品，加標100%供試品，加標120%供試品。

1.3 分析方法

Toson IC－2010離子色譜儀;色譜柱為TSKgec SuperIC－Anion HS陰離子色譜柱(4.6 mm i.d.×10 cm，3.5 μm);流動相為7.5 mmol/L NaHCO3－1.1 mmol/L Na2CO3;流速為1.0 mL/min;柱溫40℃;進樣量為30 μL;檢測器為電導(dǎo)檢測器。

2 結(jié)果與討論

2.1 濾紙選擇

通過對比研究杭州特種紙業(yè)有限公司和撫順市民政濾紙廠兩廠家濾紙，發(fā)現(xiàn)杭州特種紙業(yè)有限公司濾紙中的Cl－含量明顯低于后者，故實驗均選用杭州特種紙業(yè)有限公司所生產(chǎn)的濾紙。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

陰離子色譜法中常用的流動相有NaOH溶液和NaHCO3－Na2CO3溶液，分別選擇2.5 mmol/L NaOH溶液、5.0 mmol/L NaOH溶液、7.5 mmol/L NaHCO3－1.1 mmol/L Na2CO3溶液為流動相，按照“1.3”方法，進樣方法開發(fā)溶液。結(jié)果顯示，以氫氧化鈉溶液作流動相時，基線波動較大，且樣品峰拖尾嚴重，峰形對稱性差;以NaHCO3－Na2CO3溶液為流動相時基線平緩，峰形對稱性較好，故選擇NaHCO3－Na2CO3溶液作為流動相。通過對NaHCO3－Na2CO3溶液濃度的考察，最終選擇7.5 mmol/L NaHCO3－1.1 mmol/L Na2CO3水溶液為流動相。

以7.5 mmol/L NaHCO3－1.1 mmol/L Na2CO3水溶液為流動相，按照“1.3”方法，分別在柱溫25，30，40℃條件下進樣方法開發(fā)溶液。結(jié)果顯示柱溫越高，色譜峰展寬越小，峰形越好，分析時間越短，考慮到TSKgec SuperIC－Anion HS陰離子柱允許使用的最高柱溫為40℃，因此實驗選擇柱溫為40℃。以7.5 mmol/L NaHCO3－1.1 mmol/L Na2CO3水溶液為流動相，按照“1.3”方法，分別在流速為0.8，1.0，1.2 mL/min條件下進樣方法開發(fā)溶液，結(jié)果顯示，流速越高，色譜峰展寬越小，峰形對稱性更佳，分析時間更短，考慮到陰離子柱的耐壓情況及保養(yǎng)維護，實驗選擇最佳流速為1.0 mL/min。

2.3 供試樣品制備原理

采取氧瓶燃燒法使水合氯醛中的有機氯轉(zhuǎn)化為無機氯，經(jīng)NaOH溶液吸收后以Cl－形式存在。選擇體積為500 mL的氧瓶以獲取充足的氧氣容量使樣品燃燒充分，確保有機氯能夠完全轉(zhuǎn)化為無機氯。吸收液為20 mL 0.05 mol/L NaOH，相對樣品中轉(zhuǎn)化的痕量Cl－，該吸收液NaOH足量，以確保能夠完全吸收Cl－。

由于濾紙中不可避免會引入Cl－，因此在供試品制備時，要平行制備濾紙對照溶液，計算供試品中Cl－含量時予以扣除。

2.4 分析方法的驗證

圖2 方法專屬性實驗色譜圖Fig.2 Chromatograms of specificity of the method

2.4.2 線性及范圍、檢出限與定量下限 分別精密量取Cl－儲備液0.25，0.4，0.5，0.6，0.8 mL至5個100 mL容量瓶中，加超純水定容至刻度，搖勻，配成濃度為0.025，0.04，0.05，0.06，0.08 mg/L的線性溶液。按照“1.3”方法進樣分析，以Cl－峰面積(y)對Cl－濃度(x，mg/L)進行線性回歸，結(jié)果顯示，Cl－濃度在0.025～0.080 mg/L范圍線性關(guān)系良好，能夠滿足Cl－含量的測定要求，回歸方程為y=15.29x－0.1316，r=0.999 9。

精密量取10 mg/L的Cl－儲備液進行逐級稀釋，按照“1.3”方法進樣分析，以儀器信噪比(S/N)為3計算方法的檢出限，得到Cl－的檢出限為0.01 μg/L。以S/N約為10時計算方法的定量下限，得到Cl－的定量下限為0.05 μg/L，相當于水合氯醛定量下限為0.078 μg/L。

2.4.3 重現(xiàn)性 按照“1.3”方法進樣分析Cl－標準對照溶液，連續(xù)進樣6針，計算Cl－色譜峰面積的RSD為1.7%，表明方法的精密度良好。按照“1.3”方法，由不同的實驗人員，在不同的實驗日期，進樣分析Cl－標準對照溶液，分別連續(xù)進樣6針，計算Cl－色譜峰面積的RSD為0.50%，12針樣品的RSD為1.4%，表明方法的中間精密度良好。

2.4.4 準確度 按照“1.3”方法，對加標80%供試品，加標100%供試品，加標120%供試品分別進行測定，扣除樣品中由濾紙引入的Cl－量，以外標法計算加標回收率，得到Cl－的加標回收率為92.9%～103.4%，RSD為6.4%(表1)，結(jié)果表明該方法的準確度良好。

表1 回收率實驗結(jié)果Table 1 Result of recovery test

2.4.5 樣品穩(wěn)定性 按“1.2”供試品溶液加標的配制方法，加入0.4 mL 10 mg/mL的Cl－，用水定容后，搖勻即得測試樣品。按照“1.3”方法，分別在0，1，2，4，8，12 h對測試液進行測定，結(jié)果顯示Cl－峰面積的RSD為2.8%，表明樣品在12 h內(nèi)的穩(wěn)定性良好。

2.4.6 方法耐用性 按“1.2”供試品溶液加標的配制方法，加入0.5 mL 10 mg/mL的Cl－，用水定容后，搖勻即得樣品穩(wěn)定性測試溶液。按照“1.3”方法，分別設(shè)置流速為0.8，1.0，1.2 mL/min;柱溫為38，40，42℃;緩沖液濃度為8.25 mmol/L NaHCO3－1.21 mmol/L Na2CO3、7.5 mmol/L NaHCO3－1.1 mmol/L Na2CO3、6.75 mmol/L NaHCO3－0.99 mmol/L Na2CO3;考察流速、柱溫以及鹽濃度變化時對Cl－含量測定結(jié)果的影響。結(jié)果顯示:柱溫、流速、緩沖液濃度在一定范圍內(nèi)變化對樣品中氯離子的分離和含量測定無明顯影響，均能達到基線分離;Cl－含量測定結(jié)果的RSD分別為5.9%，2.7%，5.0%(表2)，表明該方法的流速耐用性、柱溫耐用性以及鹽濃度耐用性均良好。

表2 耐用性實驗結(jié)果Table 2 Result of robustness test

(續(xù)表2)

2.4.7 樣品檢測 按照“1.3”方法，分別進樣分析3批供試品溶液，記錄色譜圖，以外標法計算Cl－含量。結(jié)果顯示，3批樣品中的Cl－含量均低于0.02%，折換成水合氯醛，3批樣品中的水合氯醛含量均不大于0.03%，符合質(zhì)量標準中對格列喹酮主環(huán)物中水合氯醛含量的要求。

3 結(jié)論

該方法通過氧瓶燃燒法使格列喹酮主環(huán)物中的有機氯轉(zhuǎn)化為無機氯離子，經(jīng)氫氧化鈉水溶液吸收后，運用離子色譜法測定供試品溶液中的氯離子含量，從而間接測定格列喹酮主環(huán)物中水合氯醛的含量。該方法準確、有效、靈敏，能夠滿足格列喹酮主環(huán)物中水合氯醛的定量檢測要求。

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