NHEJ信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達與宮頸鱗癌同步放化療敏感性的關(guān)系

許義松，周文靜，祁曉麗，席 佩，戴鵬高

(西北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，陜西西安 710069)

宮頸癌是常見的一種女性惡性腫瘤，全世界每年新增45萬～50萬例患者，其中鱗癌為最常見的病理類型。在我國，近十幾年來宮頸癌的發(fā)病率和死亡率呈現(xiàn)升高的趨勢［1-2］。目前，將放射治療及以順鉑為基礎(chǔ)的化學(xué)藥物治療相結(jié)合的治療方式，已成為臨床上治療的IIB期及以上分期宮頸癌的標(biāo)準(zhǔn)方法，通常稱之為同步放化療。相對于傳統(tǒng)的單獨放療及其他治療手段，接受同步放化療的患者群體擁有更長的生存期及更為輕微的毒副作用。然而，仍有相當(dāng)一部分患者無法從中受益［3-4］。因此，發(fā)現(xiàn)與宮頸癌放化療敏感性的分子標(biāo)志物具有重要意義。

同步放化療主要通過誘發(fā)各種類型的DNA損傷來達到治療腫瘤的效果，其中DNA雙鏈斷裂(DNA double strand break，DSB)損傷與殺死腫瘤細胞密切相關(guān)［5］。細胞通過激活 NHEJ和 HR(homologous recombination)信號通路修復(fù)DSB損傷，其中NHEJ是主要的修復(fù)途徑［6-9］。腫瘤細胞的NHEJ系統(tǒng)與細胞生存密切相關(guān)，因此也是放化療敏感性的重要決定因素。多項研究表明，NHEJ信號通路中關(guān)鍵信號轉(zhuǎn)導(dǎo)基因的表達與乳腺癌［10］、鼻咽癌［11］、咽喉癌［12］等惡性腫瘤的放/化療敏感性密切有關(guān)。本研究主要探索NHEJ信號通路中關(guān)鍵基因 XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC和DCLRE1C的mRNA表達水平與宮頸鱗癌患者同步放化療敏感性的關(guān)系，進而找到預(yù)測宮頸鱗癌同步放化療敏感性的分子標(biāo)志物。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取42名于2013年11月至2014年5月在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的宮頸鱗癌患者。所有組織樣本均為治療前的活檢標(biāo)本，并且病理檢查均為鱗癌;依據(jù)國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(The International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)制定的宮頸癌國際臨床分期標(biāo)準(zhǔn)進行臨床分期。臨床分期為:ⅠB～ⅢB期，其中ⅠB期1例，ⅡA期1例，ⅡAⅡ期3例，ⅡB期15例，ⅢB期22例);在42例樣本中有34例樣本屬于中分化程度，高分化程度有3例，低分化程度有5例;年齡47～78歲，中位年齡60歲。本實驗通過西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)并征求所有參與患者同意。

42例患者均接受同步放化療治療。具體放療方案為:采用調(diào)強適形放射治療行全盆腔體外照射，每次2Gy，每周5次，總劑量為50Gy，同時加以腔內(nèi)近距離照射，每周4～5次，A點總劑量為24～25Gy。同步化療方案為:在放療期間采用靜脈滴注方式給予順鉑40 mg/m2，每周1次，共6周。

1.2 儀器與試劑

ABI PRISM?7500 Real Time PCR System(Life);Nanodrop核酸定量儀(Thermo Forma);TRIzol試劑(Invitrogen);一步法RT-PCR試劑盒(TaKaRa);引物及探針(上海生工生物有限公司合成)。

1.3 實驗方法

1.3.1 組織中總RNA的提取 用TRizol法提取新鮮冰凍穿刺組織中總RNA，每50～100 mg勻漿組織中加入1 mL Trizol。用Nanodrop紫外分光光度儀測定RNA的濃度及純度，并通過0.01g/mL瓊脂糖凝膠鑒定RNA的完整性。

1.3.2 引物設(shè)計 從Genebank數(shù)據(jù)庫中查找并下載 XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC，DCLRE1C及GAPDH基因的mRNA序列。選擇欲設(shè)計引物探針的位置，然后將該位置的序列導(dǎo)入Primer Express 5.0軟件，進行引物和探針的設(shè)計。利用Primer Blast在線軟件對引物特異性進行評估。引物探針序列見表1。

1.3.3 熒光定量PCR檢測 反應(yīng)體系配置如下:每個反應(yīng)體系體積為20 μL，其中上下游引物用量為500 nmol/L，熒光探針為200 nmol/L，RNA模板為50 ng，TaKaRa Ex Taq HS為2 U，One Step RT-PCR BufferⅢ為10 μL，PrimeScript RT enzyme MixⅡ為 0.4 μL，Rox Reference Dye Ⅱ(50 ×)為0.4 μL，無 Rnase 超純水補足至20 μL。反應(yīng)程序分兩步，第一步，42℃持續(xù)5 min，95℃持續(xù)10s;第二步，95℃持續(xù)5s，60℃持續(xù)34s，40 個循環(huán)。每一個反應(yīng)做兩個平行反應(yīng)，最后取平均值。每個目的基因的表達值均以GAPDH為內(nèi)參基因進行標(biāo)準(zhǔn)化，計算公式為2-△Ct，其中△Ct=目的基因Ct-內(nèi)參基因Ct。實驗中6個基因及內(nèi)參基因(GAPDH)的擴增曲線圖，見圖1。

表1 7個基因的引物及探針序列Tab.1 Primer and probe sequences of seven genes

圖1 7個基因的擴增曲線圖Fig.1 The amplification figure of seven genes

1.4 患者對同步放化療敏感性評定標(biāo)準(zhǔn)

患者同步放化療結(jié)束3個月后進行復(fù)查，并根據(jù)實體瘤療效評定標(biāo)準(zhǔn)對臨床療效進行劃分:1)完全緩解(complete response，CR)——所有靶病灶完全消失;2)部分緩解(partial response PR)——所有靶病灶最大徑之和減小≥30%;3)疾病進展(progressive disease，PD)——靶病灶最大徑之和增加≥20%或有新的病灶出現(xiàn);4)疾病穩(wěn)定(stable disease，SD)——靶病灶最大徑之和的變化介于PR和PD之間［13］。將近期療效CR患者視為對同步放化療有應(yīng)答，近期療效PR，SD和PD患者視為對同步放化療無應(yīng)答。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，用χ2檢驗分析各基因mRNA表達水平與同步放化療敏感性之間的關(guān)系，用Logistic回歸進一步分析同步放化療敏感性相關(guān)因素。當(dāng)P＜0.05時，有統(tǒng)計學(xué)意義上的顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC和DCLRE1C mRNA表達與宮頸鱗癌同步放化療敏感性的關(guān)系

據(jù)實體瘤療效評定標(biāo)準(zhǔn)，42例患者對同步放化療有應(yīng)答的為29例，無應(yīng)答的為13例。用每個基因mRNA表達值的中位值來定義其表達水平，其中mRNA表達值≥中位值計為高表達，mRNA表達值＜中位值則計為低表達。6個基因的mRNA表達水平與同步放化療敏感性之間的關(guān)系，見表2。結(jié)果表明，XRCC6 mRNA高表達的患者在CR組和PR+SD+PD組中分別占34.5%和84.6%，XRCC6 mRNA低表達患者在CR組和PR+SD+PD組中分別占65.5%和15.4%(P=0.003)。在 XRCC4，LIG4，XRCC5，PRKDC 及DCLRE1C mRNA高表達組和低表達組中，患者應(yīng)答率沒有顯著差異(P＞0.05)。

2.2 宮頸鱗癌同步放化療敏感性相關(guān)因素Logistic回歸分析

將患者的臨床信息與XRCC6 mRNA表達一起納入Logistic多因素回歸分析。結(jié)果顯示，只有XRCC6表達水平與放化療敏感性有顯著性關(guān)聯(lián)，而患者的年齡、瘤塊大小和FIGO分期則與患者的臨床療效無關(guān)，XRCC6高表達是降低同步放化療敏感性的獨立危險因素(OR 10.694，95%CI 1.872～61.094;P=0.008)，見表3。

表2 NHEJ信號通路關(guān)鍵基因mRNA表達與宮頸鱗癌同步放化療敏感性的關(guān)系Tab.2 The relationship between mRNA levels of genes involved in the NHEJ pathway and concurrent chemoradiotherapy sensitivity in squamous cell cervical cancer

表3 宮頸鱗癌同步放化療敏感性相關(guān)因素Logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of influential factors on synchronous chemoradiotherapy sensitivity in squamous cell cervical carcinoma

3 討論

NHEJ信號通路可以修復(fù)由同步放化療引發(fā)的DSB損傷［6］。由于其修復(fù)過程不需要同源DNA模板，可以發(fā)生在整個細胞周期中，是修復(fù)DSB 的 主 要 信 號 通 路［8-9］。XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC和DCLRE1C參與整個修復(fù)過程，這些關(guān)鍵基因的表達水平會影響該通路的功能，因而可以進一步影響細胞對放化療的敏感性。本研究通過qRT-PCR法測定42例宮頸鱗癌患者 XRCC4，XRCC5，XRCC6，LIG4，PRKDC和DCLRE1C的mRNA表達值，在應(yīng)答組的29例樣本中，XRCC4 PRKDC分別有1例樣本未檢測出表達值。經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)，XRCC6的mRNA表達水平與患者接受同步放化療治療的敏感性密切相關(guān)，XRCC6低表達患者對同步放化療敏感，且近期療效更好。

XRCC6編碼的Ku70蛋白是NHEJ信號通路中最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子之一［14-15］。DSB發(fā)生時，Ku復(fù)合物(Ku70和Ku80)識別并結(jié)合到DSB末端，并為該通路中其他修復(fù)蛋白的結(jié)合提供支架［16］。大量研究表明，腫瘤細胞中Ku70表達與放化療抵抗有密切的關(guān)系。采用基因敲除技術(shù)去除小鼠胚胎干細胞中XRCC6基因，建立XRCC6基因敲除鼠動物模型，小鼠表現(xiàn)出對電離輻射異常敏感和生長遲緩等現(xiàn)象［17］。體外研究發(fā)現(xiàn)，通過向人宮頸癌HeLa細胞系轉(zhuǎn)染靶向抑制Ku70的ShRNA來抑制細胞系Ku70蛋白表達，可以顯著提高細胞的對化療藥物的敏感性［18］。最近用免疫組化法檢測治療前、后IB-IIA期宮頸癌組織中Ku70蛋白表達，發(fā)現(xiàn)Ku70的表達量在放療殘留組織中增加［19］。本實驗與相關(guān)研究報道的結(jié)果一致，提示XRCC6 mRNA表達水平升高可導(dǎo)致Ku70蛋白表達增加及NHEJ修復(fù)能力增強，最終引起對同步放化療的反應(yīng)降低。XRCC4，XRCC5，LIG4，PRKDC和DCLRE1C基因與腫瘤的放化療敏感性未發(fā)現(xiàn)存在顯著相關(guān)性。一方面可能是由于XRCC6引起的放化療敏感性是通過其他細胞信號通路影響細胞的生長;另一方面所用的樣本量偏小，尚未能發(fā)現(xiàn)這些基因與腫瘤放化療敏感性。由于研究的樣本都為穿刺組織，組織量少，因此本實驗只是在RNA水平上來驗證，且樣本量非常有限，更加可靠性的結(jié)論需要大樣本研究驗證。

綜上所述，NHEJ信號通路中XRCC6 mRNA表達水平與宮頸鱗癌患者接受同步放化療治療的敏感性密切相關(guān)。在患者進行治療之前，先對其活檢組織中XRCC6 mRNA表達水平進行檢測，這樣就能有效地預(yù)測其臨床療效。

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