瘤胃纖毛蟲(chóng)的殼多糖酶

（青島科技大學(xué)化工學(xué)院，山東青島266042）

1 介紹

瘤胃中的原蟲(chóng)能迅速吞沒(méi)真菌孢子，這些孢子在角素中大量存在[1]。我們還發(fā)現(xiàn)，纖毛蟲(chóng)能消化和發(fā)酵角素[2]。但是，一些種類的瘤胃原蟲(chóng)的有關(guān)殼多糖酶信息還不完全。本研究的目的是將纖毛蟲(chóng)的這些殼聚糖酶進(jìn)行識(shí)別和特征描述。

2 材料和方法

Dogiel[3]識(shí)別出了纖毛蟲(chóng)E.maggii,它們是從天然綿羊種群的瘤胃中分離出來(lái)。這些纖毛蟲(chóng)根據(jù)Michslowski等[4]提出的方法在體外培養(yǎng)，然后被注射到?jīng)]有纖毛蟲(chóng)的綿羊的瘤胃中[5]。生活在單一動(dòng)物區(qū)系的綿羊的瘤胃中的纖毛蟲(chóng)會(huì)繼續(xù)它們的酶工作。液體樣品取自瘤胃，其中的原蟲(chóng)被分離出來(lái)并經(jīng)離心純化[6]。純化后的纖毛蟲(chóng)在抗生素混合物（氯霉素、鏈霉素、氨芐青霉素）中進(jìn)行過(guò)夜孵化，每種物質(zhì)的濃度為50μg/mL。使用抗生素的目的是為了限制細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的生長(zhǎng)。孵化后，用溫?zé)岬柠}水（40℃）對(duì)纖毛蟲(chóng)清洗三次[7]。最后，對(duì)它們進(jìn)行離心法濃縮并在-80℃下儲(chǔ)存。為了制備酶制劑，我們將冰凍的纖毛蟲(chóng)融化并放在一個(gè)含有研棒的高速攪拌器中進(jìn)行均化。所得的均化物經(jīng)過(guò)離心（22,000×g，30min，4℃）處理，將浮在表面的物質(zhì)收集起來(lái)作為粗酶制劑。在粗酶中孵化出來(lái)的羧甲基角素會(huì)產(chǎn)生糖[8]，內(nèi)殼多糖酶的活性是由羧甲基角素釋放的這些糖減少的數(shù)量來(lái)確定的。反應(yīng)混合物包含0.4mL培養(yǎng)基、0.4mL酶制劑和0.2mL的0.1mol/L的檸檬酸鹽—硫酸鹽緩沖液。混合物于40℃下孵化1min，所釋放的物質(zhì)根據(jù)Miller等[9]提出的方法用光譜光度測(cè)量法進(jìn)行檢測(cè)。外殼多糖酶和β-N-乙?；咸烟擒彰傅幕钚允峭ㄟ^(guò)測(cè)量硝基苯的數(shù)量來(lái)確定的，這些硝基苯是由粗酶制劑分別作用于對(duì)4-硝基-N,N-二乙?；?D-殼二糖和4-硝基苯-β-N-乙酰基氨基葡萄糖苷而產(chǎn)生的。反應(yīng)混合物包括濃度為1μmol/L的培養(yǎng)基溶液100μL，50μL酶制劑和150μL 0.1mol/L的檸檬酸鹽-硫酸鹽緩沖液。混合物于40℃下孵化1h，根據(jù)Yem和Wu[10]提出的方法進(jìn)行定量測(cè)量。對(duì)粗酶制劑進(jìn)行聚丙烯酰胺電泳（PAGE），再加上酶譜分析，可以識(shí)別出角素降解酶[8]。羧甲基-角素，4-甲基香豆素-β-D-N,N-二乙?；鶜ざ呛?-甲基香豆素-N-乙?；?β-氨基葡萄糖作為特定物質(zhì)加入到培養(yǎng)基中，用于分離凝膠以識(shí)別內(nèi)殼多糖酶，外殼多糖酶和β-N-乙酰基葡萄糖苷酶。

表1 E.maggii殼多糖酶的特性

3 結(jié)果和討論

我們的研究表明E.maggii纖毛蟲(chóng)擁有內(nèi)殼多糖酶，外殼多糖酶和β-N-乙?；咸烟擒彰?，是這些酶催化角素降解得到的。這個(gè)發(fā)現(xiàn)支持了關(guān)于殼多糖性質(zhì)的早期研究結(jié)果[11]。他們的結(jié)果也表明最具活性的是β-N-乙酰基葡萄糖苷酶。其活性是Williams等[12]在E.mggii中發(fā)現(xiàn)的類似的酶的活性的12倍。內(nèi)殼多糖酶和外殼多糖酶的活性相似（p＞0.05）,它們大約只有β-N-乙?；咸烟擒彰傅幕钚缘囊话耄ㄒ?jiàn)表1）。

圖1 根據(jù)酶譜技術(shù)識(shí)別出的瘤胃纖毛蟲(chóng)E.maggii的殼多糖酶；用PAGE法分離出原蟲(chóng)蛋白質(zhì)。

總之，六個(gè)蛋白質(zhì)帶展示了它們對(duì)角素的降解能力或者說(shuō)是它們的降解物數(shù)量（圖1）。兩個(gè)是來(lái)自內(nèi)殼多糖酶，兩個(gè)來(lái)自外殼多糖酶，還有兩個(gè)來(lái)自β-N-乙酰基葡萄糖苷酶。

[1]Lee Ss,Ha JK,Cheng K-J.The effects of sequential inoculation of mixed rumen protozoa on the degradation of orchard grass cell walls by anaerobic fungus Anaeromyces mucronatus[J].Can J Microbiol 2001 47(8):754-760.

[2]Miltko R,Belzecki G,Kwiatkowska E,et al.The ability of the rumen protozoan Eudiplodinium maggii to utilize chitin[J].Folia Microbiol 2010 55:349-351.

[3]Dogiel VA.Monographie der Familie Ophryoscolecidae[J].Arch Protistenk 1927 59:1-288.

[4]Michalowski T,Muszynski P,Landa I.Factors influencing the growth of rumen ciliates Eudiplodinium maggii in vitro[J].Acta Protozool 1991 25:419-426.

[5]Michalowski T,Harmeyer J,Belzecki G.The importance of washing the omasum for successful defaunation of sheep[J].Anim Feed Sci 1999 8:611-619.

[6]Michalowski T.The distribution of ciliates through the reticulorumen of sheep[J].Acta Protozool 1990 29:213-222.

[7]Coleman GS,Davies JI,Cash MA.The cultivation of rumen ciliates Epidinium ecaudatum caudatum and Polyplastron multivesiculatum in vitro[J].J Gen Microbiol 1972 73:509-521.

[8]Wirth SJ,Wolf GA.Day-label substrates for the assay and detection of chitinase and lysozyme activity[J].J Microbiol Method 1990 12:197-205

[9]Miller GL,Blum R,Glennon WE,et al.Measurement of carboxymethylcellulase activity[J].Anal Biochem 1960 2:127-132.

[10]Yem DW,Wu HC.Purification and properties of β-N-acetyloglucosoamidase from Escherichia coli[J].J Bacteriol 1976 12(5):324-331.

[11]Belzecki G,Miltko R,Michalowski T,et al.Chitinolytic activity of the sheep rumen ciliate Diploplastron affine[J].Folia Microbiol 2008 53(3):201-203.

[12]Williams AG,Ellis AB,Coleman AG.Subcellular distribution of polysaccharide depolymerase and glycoside enzymes in rumen ciliate protozoa[J].Curr Microbiol 1986 13:139-147.