微柱凝膠法在不規(guī)則抗體特異性鑒定中的應(yīng)用

粟明麗

【摘要】 目的：探討微柱凝膠法在血型不規(guī)則抗體特異性鑒定中的應(yīng)用。方法：分別用鹽水法、抗人球蛋白法、微柱凝膠法對(duì)筆者所在醫(yī)院64例不規(guī)則抗體陽(yáng)性患者進(jìn)行抗體特異性鑒定。結(jié)果：鹽水法檢出2例抗體，抗人球蛋白法檢出55例抗體，微柱凝膠法檢出62例抗體。其中Rh系統(tǒng)抗體24例，MNSs系統(tǒng)11例，Lewis系統(tǒng)9例，Diego系統(tǒng)2例，抗-E聯(lián)合抗-Mur 1例，未確認(rèn)抗體特異性17例。結(jié)論：微柱凝膠法應(yīng)用于不規(guī)則抗體特異性鑒定敏感性高、特異性強(qiáng)，操作簡(jiǎn)便、快捷，結(jié)果判讀清晰易于標(biāo)準(zhǔn)化。

【關(guān)鍵詞】 微柱凝膠法； 抗人球蛋白法； 不規(guī)則抗體； 抗體特異性

不規(guī)則抗體是指抗A、抗B以外的血型抗體，在臨床上易引起輸血不良反應(yīng)、新生兒溶血病、血型鑒定及交叉配血困難等。輸血前對(duì)受血者進(jìn)行血型不規(guī)則抗體篩選、特異性鑒定及交叉配血試驗(yàn)，是確保臨床輸血安全和有效的重要措施。筆者所在醫(yī)院采用鹽水法、抗人球蛋白法、微柱凝膠法對(duì)擬輸血和手術(shù)的患者進(jìn)行血型不規(guī)則抗體篩選，對(duì)結(jié)果陽(yáng)性者再進(jìn)行抗體特異性鑒定，為患者選擇相應(yīng)抗原陰性及交叉配血試驗(yàn)相合的血液進(jìn)行輸注，保證了臨床輸血治療的安全性和有效性。

1 材料與方法

1.1 一般資料 選自筆者所在醫(yī)院2012年10月-2014年2月住院申請(qǐng)輸血和手術(shù)備血的7596例患者篩查出的不規(guī)則抗體陽(yáng)性64例，年齡26～85歲，男16例，女48例，有輸血史或妊娠史者52例，無(wú)輸血史或妊娠史者12例。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 全自動(dòng)血型與配血分析系統(tǒng)（強(qiáng)生公司）；Diana微柱凝膠抗球蛋白卡、低離子介質(zhì)溶液、專(zhuān)用孵育器、離心機(jī)（西班牙黛安娜公司）；KA-2200離心機(jī)（日本九保田公司）；上海產(chǎn)的電熱恒溫水浴箱?？谷饲虻鞍自噭⒖贵w篩選細(xì)胞、譜細(xì)胞、抗M抗體、抗P1抗體、抗C抗體、抗c抗體、抗D抗體、抗E抗體、抗e抗體、2-Me試劑（上海血液生物醫(yī)藥有限責(zé)任公司）；試劑均批檢合格并在有效期內(nèi)使用。

1.2.2 不規(guī)則抗體的篩查 取患者EDTA二鉀鹽抗凝血標(biāo)本4 mL，未抗凝標(biāo)本4 mL，3000 r/min離心5 min后，采用鹽水介質(zhì)（室溫、4 ℃、37 ℃）和微柱凝膠抗球蛋白法同時(shí)檢測(cè)參照文獻(xiàn)[1]，全自動(dòng)分析系統(tǒng)檢測(cè)出的陽(yáng)性結(jié)果再用Diana微柱凝膠抗球蛋白卡復(fù)查。

1.2.3 不規(guī)則抗體特異性鑒定

1.2.3.1 鹽水法和抗人球蛋白法 在11支試管內(nèi)分別加入1至10號(hào)譜細(xì)胞及洗滌三次的2%～5%自身細(xì)胞懸液各1滴，各加入被檢者血清2滴，混勻，分別置室溫、4 ℃、37 ℃下離心觀察并記錄結(jié)果，后置37 ℃孵育1 h，用生理鹽水洗滌3次，倒盡末次洗滌的鹽水，吸干試管邊緣的水分，于試管內(nèi)加入抗人球蛋白試劑2滴，3000 r/min離心15 s，觀察結(jié)果，有凝集者為陽(yáng)性，無(wú)凝集者為陰性；同時(shí)用IgG抗D致敏的2%～5%的O型RhD陽(yáng)性壓積紅細(xì)胞做陽(yáng)性對(duì)照，AB血清2滴加2%～5%的O型RhD陽(yáng)性壓積紅細(xì)胞做陰性對(duì)照。

1.2.3.2 微柱凝膠法 在微柱凝膠卡上標(biāo)記被檢者姓名及譜細(xì)胞的編號(hào)、自身細(xì)胞，用微量加樣器分別加入低離子液稀釋的0.8%～1%的譜細(xì)胞懸液、自身細(xì)胞懸液各50 μL，后加被檢者血漿25 μL于微柱凝膠卡中，置37 ℃專(zhuān)用孵育器內(nèi)孵育15 min，1100 r/min離心9 min，肉眼觀察結(jié)果。紅細(xì)胞均勻沉于管底者為陰性，懸浮于凝膠表面或凝膠中段者為陽(yáng)性。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)細(xì)胞譜確定抗體的特異性。對(duì)鑒定為特異性抗體者，采用相對(duì)應(yīng)的抗體試劑檢測(cè)紅細(xì)胞抗原是否為陰性，以確認(rèn)所檢抗體的準(zhǔn)確性。

1.2.4 不規(guī)則抗體免疫球蛋白類(lèi)別鑒定方法 采用巰基試劑（2-Me）區(qū)分IgG和IgM技術(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，檢驗(yàn)采用配對(duì)計(jì)數(shù)資料的 字2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3種方法對(duì)血型抗體特異性鑒定結(jié)果 64例不規(guī)則抗體陽(yáng)性患者，鹽水法檢出特異性抗體2例，抗人球蛋白法檢出55例抗體，微柱凝膠法檢出62例抗體?？谷饲虻鞍追ê臀⒅z法兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。

2.2 不規(guī)則抗體特異性分布 64例不規(guī)則抗體陽(yáng)性患者中Rh系統(tǒng)抗體24例，MNSs系統(tǒng)11例，Lewis系統(tǒng)9例，Diego系統(tǒng)2例?？笵 3例、抗Ec 11例、抗E 9例、抗M 7例、抗 Lea 8例，抗Mur、抗Dia各2例，抗c、抗N、抗Leb、抗s各1例，抗-E聯(lián)合抗-Mur 1例，未確認(rèn)抗體特異性17例。

3 討論

不規(guī)則抗體分為IgM和IgG類(lèi)抗體，IgM抗體是天然產(chǎn)生的，IgG抗體是通過(guò)妊娠免疫、注射、異型輸血等刺激產(chǎn)生的，其分子量小可通過(guò)胎盤(pán)引起新生兒溶血病及輸血不良反應(yīng)。輸血前常規(guī)檢查不規(guī)則抗體并進(jìn)行抗體特異性鑒定對(duì)保障安全輸血至關(guān)重要。目前用于抗體特異性鑒定的方法有鹽水法、凝聚胺法、抗人球蛋白法、微柱凝聚法等。鹽水法用于檢測(cè)IgM類(lèi)抗體，在4 ℃反應(yīng)最強(qiáng)，37 ℃減弱，為了避免冷凝集干擾分別置室溫、4 ℃、37 ℃三種溫度下檢測(cè)。本實(shí)驗(yàn)中鹽水法檢出的2例抗M抗體，凝聚胺法、抗人球蛋白法、微柱凝膠法均為陰性。

凝聚胺法易受到冷凝集素、肝素的影響，不能檢出Kell血型系統(tǒng)的抗-K抗體，判讀結(jié)果時(shí)間短需在1 min之內(nèi)看結(jié)果、易受振搖力度的影響，凝集用力振搖或放置時(shí)間稍長(zhǎng)可能消失，對(duì)抗E抗體漏檢[2]，對(duì)低濃度抗體不能檢出[3]，抗人球蛋白法和微柱凝膠法無(wú)法確定抗體特異性的再用凝聚法復(fù)檢，本實(shí)驗(yàn)中無(wú)一例凝聚胺法檢測(cè)陽(yáng)性其他方法檢測(cè)陰性的患者，它適用于急診搶救患者的交叉配血。

抗人球蛋白法較為經(jīng)典，技術(shù)要求高，操作時(shí)間長(zhǎng)，繁瑣，需要洗滌細(xì)胞，易受人為因素的影響，此方法檢出陽(yáng)性特異性抗體55例，有7例微柱凝膠法陽(yáng)性患者抗人球蛋白法檢測(cè)為陰性，經(jīng)檢驗(yàn)兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。endprint

微柱凝膠法是血型血清學(xué)方法的一項(xiàng)新的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)微柱凝膠的微孔過(guò)濾作用和抗原抗體特異性反應(yīng)作用，經(jīng)低速離心后，利用微柱凝膠層析分子排阻原則將發(fā)生凝集反應(yīng)的紅細(xì)胞阻滯于凝膠上層，呈陽(yáng)性，而游離的單個(gè)紅細(xì)胞，則穿過(guò)微孔到達(dá)凝膠底部，呈陰性反應(yīng)，廣泛用于血型鑒定，交叉配血試驗(yàn)，不規(guī)則抗體篩查，直接抗人球蛋白試驗(yàn)等，對(duì)自身免疫性溶血性貧血（AIHA）的診斷具有重要價(jià)值[4]。其靈敏度高于抗人球蛋白法[5-9]，特異性強(qiáng)，操作標(biāo)準(zhǔn)化，簡(jiǎn)便，快捷，標(biāo)本用量少，結(jié)果判讀清晰，可照相存檔，省去抗人球蛋白法洗細(xì)胞的麻煩，缺點(diǎn)就是成本高，對(duì)多發(fā)性骨髓瘤及巨球蛋白血癥患者由于血清中產(chǎn)生大量M蛋白包裹紅細(xì)胞，易于聚集呈緡錢(qián)樣改變，產(chǎn)生假凝集[10]，需用抗人球蛋白法檢測(cè)。細(xì)胞懸液濃度需嚴(yán)格控制在0.8%～1%，否則易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性。此方法檢出特異性抗體62例，有2例抗Ec聯(lián)合抗體用抗人球蛋白法檢測(cè)為抗E，漏檢抗c。

64例不規(guī)則抗體特異性分布中Rh系統(tǒng)所占比例最高，Rh血型抗體主要通過(guò)輸血或妊娠免疫產(chǎn)生的免疫性IgG抗體，是引起免疫性溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血癥最常見(jiàn)的不規(guī)則抗體[11-13]，重要性?xún)H次于ABO血型系統(tǒng)，本實(shí)驗(yàn)中大多數(shù)為女性患者和有輸血史/妊娠史患者，接受免疫刺激的機(jī)會(huì)多，所產(chǎn)生的抗體比率高。如輸血科條件允許可做Rh系統(tǒng)分型，選分型相同的血液進(jìn)行輸注，可避免產(chǎn)生Rh系統(tǒng)抗體。MNSs系統(tǒng)、Lewis系統(tǒng)的抗體多數(shù)是天然產(chǎn)生的IgM抗體，少數(shù)為IgG抗體?？筂、抗N 抗體僅在抗球蛋白試驗(yàn)陽(yáng)性或37 ℃時(shí)才有臨床意義，能引起新生兒溶血病。Diego系統(tǒng)中Dia的抗原頻率低，檢出的抗體少。抗-Dia亦能引起新生兒溶血病。Lewis系統(tǒng)中抗Lea所占比例最高8例，抗-Lewis抗體多數(shù)是IgM型，在37 ℃抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)中有反應(yīng)，此反應(yīng)比室溫時(shí)的反應(yīng)弱。未確定特異性抗體占26.56%，其原因有：（1）自身抗體和同種抗體同時(shí)存在；（2）是幾種抗體聯(lián)合在一起無(wú)法辨別；（3）抗體減弱與譜細(xì)胞格局不符；（4）有低頻率抗原的可能；（5）自身抗體比如紅斑狼瘡、自身免疫性溶血性貧血引起的[14-15]。

綜上所述，對(duì)擬輸血和手術(shù)的患者常規(guī)進(jìn)行血型不規(guī)則抗體篩選，對(duì)結(jié)果陽(yáng)性者再用鹽水法、微柱凝膠法進(jìn)行抗體特異性鑒定，未確定抗體特異性者用抗人球蛋白法和凝聚胺法復(fù)檢，有利于早期發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)具有臨床意義的抗體，以使抗體陽(yáng)性的患者在術(shù)前盡早獲得相配合的血液，確保輸血安全。同時(shí)對(duì)有輸血史或妊娠史的孕婦做產(chǎn)前抗體篩查，檢出血型不規(guī)則抗體，降低新生兒溶血癥的發(fā)生率。

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（收稿日期：2014-05-13） （本文編輯：石亞飛）endprint

微柱凝膠法是血型血清學(xué)方法的一項(xiàng)新的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)微柱凝膠的微孔過(guò)濾作用和抗原抗體特異性反應(yīng)作用，經(jīng)低速離心后，利用微柱凝膠層析分子排阻原則將發(fā)生凝集反應(yīng)的紅細(xì)胞阻滯于凝膠上層，呈陽(yáng)性，而游離的單個(gè)紅細(xì)胞，則穿過(guò)微孔到達(dá)凝膠底部，呈陰性反應(yīng)，廣泛用于血型鑒定，交叉配血試驗(yàn)，不規(guī)則抗體篩查，直接抗人球蛋白試驗(yàn)等，對(duì)自身免疫性溶血性貧血（AIHA）的診斷具有重要價(jià)值[4]。其靈敏度高于抗人球蛋白法[5-9]，特異性強(qiáng)，操作標(biāo)準(zhǔn)化，簡(jiǎn)便，快捷，標(biāo)本用量少，結(jié)果判讀清晰，可照相存檔，省去抗人球蛋白法洗細(xì)胞的麻煩，缺點(diǎn)就是成本高，對(duì)多發(fā)性骨髓瘤及巨球蛋白血癥患者由于血清中產(chǎn)生大量M蛋白包裹紅細(xì)胞，易于聚集呈緡錢(qián)樣改變，產(chǎn)生假凝集[10]，需用抗人球蛋白法檢測(cè)。細(xì)胞懸液濃度需嚴(yán)格控制在0.8%～1%，否則易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性。此方法檢出特異性抗體62例，有2例抗Ec聯(lián)合抗體用抗人球蛋白法檢測(cè)為抗E，漏檢抗c。

64例不規(guī)則抗體特異性分布中Rh系統(tǒng)所占比例最高，Rh血型抗體主要通過(guò)輸血或妊娠免疫產(chǎn)生的免疫性IgG抗體，是引起免疫性溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血癥最常見(jiàn)的不規(guī)則抗體[11-13]，重要性?xún)H次于ABO血型系統(tǒng)，本實(shí)驗(yàn)中大多數(shù)為女性患者和有輸血史/妊娠史患者，接受免疫刺激的機(jī)會(huì)多，所產(chǎn)生的抗體比率高。如輸血科條件允許可做Rh系統(tǒng)分型，選分型相同的血液進(jìn)行輸注，可避免產(chǎn)生Rh系統(tǒng)抗體。MNSs系統(tǒng)、Lewis系統(tǒng)的抗體多數(shù)是天然產(chǎn)生的IgM抗體，少數(shù)為IgG抗體?？筂、抗N 抗體僅在抗球蛋白試驗(yàn)陽(yáng)性或37 ℃時(shí)才有臨床意義，能引起新生兒溶血病。Diego系統(tǒng)中Dia的抗原頻率低，檢出的抗體少?？?Dia亦能引起新生兒溶血病。Lewis系統(tǒng)中抗Lea所占比例最高8例，抗-Lewis抗體多數(shù)是IgM型，在37 ℃抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)中有反應(yīng)，此反應(yīng)比室溫時(shí)的反應(yīng)弱。未確定特異性抗體占26.56%，其原因有：（1）自身抗體和同種抗體同時(shí)存在；（2）是幾種抗體聯(lián)合在一起無(wú)法辨別；（3）抗體減弱與譜細(xì)胞格局不符；（4）有低頻率抗原的可能；（5）自身抗體比如紅斑狼瘡、自身免疫性溶血性貧血引起的[14-15]。

綜上所述，對(duì)擬輸血和手術(shù)的患者常規(guī)進(jìn)行血型不規(guī)則抗體篩選，對(duì)結(jié)果陽(yáng)性者再用鹽水法、微柱凝膠法進(jìn)行抗體特異性鑒定，未確定抗體特異性者用抗人球蛋白法和凝聚胺法復(fù)檢，有利于早期發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)具有臨床意義的抗體，以使抗體陽(yáng)性的患者在術(shù)前盡早獲得相配合的血液，確保輸血安全。同時(shí)對(duì)有輸血史或妊娠史的孕婦做產(chǎn)前抗體篩查，檢出血型不規(guī)則抗體，降低新生兒溶血癥的發(fā)生率。

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[8] Petrusi?-Kafedzi? A， Ivankovi? Z， Ekinovi? S， et al. Changes in the structure and clinical significance of the positive results of pretransfusion testing during the switching from tube test agglutination to gel microcolumn technique[J]. Med Glas （Zenica），2010，7（2）：124-131.

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微柱凝膠法是血型血清學(xué)方法的一項(xiàng)新的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)，通過(guò)微柱凝膠的微孔過(guò)濾作用和抗原抗體特異性反應(yīng)作用，經(jīng)低速離心后，利用微柱凝膠層析分子排阻原則將發(fā)生凝集反應(yīng)的紅細(xì)胞阻滯于凝膠上層，呈陽(yáng)性，而游離的單個(gè)紅細(xì)胞，則穿過(guò)微孔到達(dá)凝膠底部，呈陰性反應(yīng)，廣泛用于血型鑒定，交叉配血試驗(yàn)，不規(guī)則抗體篩查，直接抗人球蛋白試驗(yàn)等，對(duì)自身免疫性溶血性貧血（AIHA）的診斷具有重要價(jià)值[4]。其靈敏度高于抗人球蛋白法[5-9]，特異性強(qiáng)，操作標(biāo)準(zhǔn)化，簡(jiǎn)便，快捷，標(biāo)本用量少，結(jié)果判讀清晰，可照相存檔，省去抗人球蛋白法洗細(xì)胞的麻煩，缺點(diǎn)就是成本高，對(duì)多發(fā)性骨髓瘤及巨球蛋白血癥患者由于血清中產(chǎn)生大量M蛋白包裹紅細(xì)胞，易于聚集呈緡錢(qián)樣改變，產(chǎn)生假凝集[10]，需用抗人球蛋白法檢測(cè)。細(xì)胞懸液濃度需嚴(yán)格控制在0.8%～1%，否則易出現(xiàn)假陰性或假陽(yáng)性。此方法檢出特異性抗體62例，有2例抗Ec聯(lián)合抗體用抗人球蛋白法檢測(cè)為抗E，漏檢抗c。

64例不規(guī)則抗體特異性分布中Rh系統(tǒng)所占比例最高，Rh血型抗體主要通過(guò)輸血或妊娠免疫產(chǎn)生的免疫性IgG抗體，是引起免疫性溶血性輸血反應(yīng)和新生兒溶血癥最常見(jiàn)的不規(guī)則抗體[11-13]，重要性?xún)H次于ABO血型系統(tǒng)，本實(shí)驗(yàn)中大多數(shù)為女性患者和有輸血史/妊娠史患者，接受免疫刺激的機(jī)會(huì)多，所產(chǎn)生的抗體比率高。如輸血科條件允許可做Rh系統(tǒng)分型，選分型相同的血液進(jìn)行輸注，可避免產(chǎn)生Rh系統(tǒng)抗體。MNSs系統(tǒng)、Lewis系統(tǒng)的抗體多數(shù)是天然產(chǎn)生的IgM抗體，少數(shù)為IgG抗體?？筂、抗N 抗體僅在抗球蛋白試驗(yàn)陽(yáng)性或37 ℃時(shí)才有臨床意義，能引起新生兒溶血病。Diego系統(tǒng)中Dia的抗原頻率低，檢出的抗體少。抗-Dia亦能引起新生兒溶血病。Lewis系統(tǒng)中抗Lea所占比例最高8例，抗-Lewis抗體多數(shù)是IgM型，在37 ℃抗人球蛋白實(shí)驗(yàn)中有反應(yīng)，此反應(yīng)比室溫時(shí)的反應(yīng)弱。未確定特異性抗體占26.56%，其原因有：（1）自身抗體和同種抗體同時(shí)存在；（2）是幾種抗體聯(lián)合在一起無(wú)法辨別；（3）抗體減弱與譜細(xì)胞格局不符；（4）有低頻率抗原的可能；（5）自身抗體比如紅斑狼瘡、自身免疫性溶血性貧血引起的[14-15]。

綜上所述，對(duì)擬輸血和手術(shù)的患者常規(guī)進(jìn)行血型不規(guī)則抗體篩選，對(duì)結(jié)果陽(yáng)性者再用鹽水法、微柱凝膠法進(jìn)行抗體特異性鑒定，未確定抗體特異性者用抗人球蛋白法和凝聚胺法復(fù)檢，有利于早期發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)具有臨床意義的抗體，以使抗體陽(yáng)性的患者在術(shù)前盡早獲得相配合的血液，確保輸血安全。同時(shí)對(duì)有輸血史或妊娠史的孕婦做產(chǎn)前抗體篩查，檢出血型不規(guī)則抗體，降低新生兒溶血癥的發(fā)生率。

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