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    粒毛盤菌YM404黑色素發(fā)酵、純化及其染色效果

    2014-12-31 11:32:00郭賡藝殷坤才
    關(guān)鍵詞:對苯二胺染發(fā)劑谷胱甘肽

    郭賡藝, 蔣 科, 李 蘭, 殷坤才, 葉 明

    (1.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院,安徽 合肥 230009;2.馬鞍山市安康菌業(yè)有限公司,安徽 馬鞍山 243000)

    0 引 言

    黑色素是通過多羥基酚氧化而成的構(gòu)造不規(guī)則的類多酚聚合體[1],存在于動物、植物及微生物中,通常對溫度、pH 值、光照等較穩(wěn)定[2-3]。利用微生物發(fā)酵產(chǎn)黑色素,成本較低,易于工業(yè)化。目前人們提取黑色素常用的方法是堿提酸沉法,但難以獲得黑色素的單一組分,對其進行結(jié)構(gòu)解析比較困難[4]。研究表明,采用分級分離的方法可以獲得黑色素均一性組分[5]。

    目前市場上銷售的染發(fā)劑多為氧化型染發(fā)劑,其主要原料對苯二胺及其衍生物具有一定的毒性、致敏性以及致癌性,長期使用可能導(dǎo)致癌癥[6]。有學(xué)者以五倍子、黑芝麻、兒茶等原料制備染發(fā)劑,但其提取液對天然白發(fā)的染發(fā)效果較差[7]。因此,研究與開發(fā)天然染料的無毒染發(fā)劑具有重要的應(yīng)用價值。

    粒毛盤菌屬為腐生性真菌,深層發(fā)酵后可產(chǎn)生黑色素,但得率較低[8]。目前關(guān)于粒毛盤菌黑色素均一性組分的報道并不多。本文對粒毛盤菌YM404產(chǎn)黑色素的發(fā)酵條件進行研究,經(jīng)分級分離后獲得其胞外黑色的均一性組分,對其染色效果進行了評價,為粒毛盤菌黑色素資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株

    粒毛盤菌Lachnum YM-404菌株,子實體采集自中國云南省,由合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究室分離保藏。

    1.2 培養(yǎng)基

    固 體 培 養(yǎng) 基:ρ(葡 萄 糖)=20g/L,ρ(酵母膏)=5g/L,ρ(蛋 白 胨 )= 5g/L,ρ(瓊脂)=15g/L。

    液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基:ρ(葡萄糖)=20g/L,ρ(蛋白胨)=5g/L,V(蒸餾水)=1 000mL。

    1.3 試劑與儀器

    葡聚糖凝膠 Sephadex G-100,購自美國Pharmacia公司;海飛絲去屑洗發(fā)露,廣州寶潔有限公司;其他試劑均為分析純,購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

    立式壓力蒸汽滅菌鍋,上海申安醫(yī)療器械廠;ZHWY-2102氣浴搖床,蘇州凈化設(shè)備有限公司;冷凍干燥機,北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司;752紫外可見分光光度計,上海菁華科技儀器有限公司;ACQUITY UPLC LUT液質(zhì)聯(lián)用儀,美國Waters公司。

    1.4 黑色素發(fā)酵條件

    用打孔器接種直徑6mm、菌齡一致的YM404菌塊于裝有150mL液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中,26℃、160r/min培養(yǎng)10d。發(fā)酵液抽濾2~3次,收集發(fā)酵液,在520nm處測定其吸光度值,吸光度值越高,表明黑色素產(chǎn)量越高。菌絲體在50℃下烘干并且測定生物量(即菌絲體干質(zhì)量),生物量越大,表明YM404生長速度越快。以吸光度值和生物量為指標,考察不同碳源(葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉)、氮源(蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏)以及不同濃度L-DOPA、谷胱甘肽對YM404生長及產(chǎn)黑色素的影響,確定最佳發(fā)酵條件[8]。

    1.5 分級分離

    [9]的方法,獲得粒毛盤菌 YM404黑色素(LEM404)。參考文獻[7]的方法,采用葡聚糖G-100凝膠柱,以0.5%NaCO3為洗脫液,LEM404的質(zhì)量濃度為20mg/mL,進樣量為1mL,控制流速為300μL/min,每管收集5mL,柱溫保持20℃。收集洗脫液于520nm下測定吸光度值,繪制其洗脫曲線。收集主要組分經(jīng)減壓濃縮后,于截留分子量為200Da的透析袋中透析48h,冷凍干燥后獲得LEM404的均一組分。

    1.6 質(zhì)譜分析

    采用質(zhì)譜聯(lián)用儀對LEM 404均一組分(LEM404-a)進行質(zhì)譜分析。分析條件[10]:電噴霧離子源,離子源溫度為110℃;掃描方式為正離子V模式;質(zhì)核比的掃描范圍為100~1 000;毛細管電壓為2 400kV;去溶劑溫度為350℃;去溶劑氣流量為600L/h;錐孔電壓為60V;錐孔氣流量為40L/h。

    1.7 染色效果

    參考文獻[11]的方法配制染發(fā)劑(A劑、B劑),其中配方I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ以及Ⅴ的A劑水相中的LEM 404-a和對苯二胺的添加量見表1所列,其他成分與文獻[11]一致;配方Ⅵ只添加0.8%LEM 404-a。取同一人的白發(fā)分別浸入各配方的染發(fā)劑中,于35℃恒溫箱保溫30min,觀察染色結(jié)果。然后將染色后的頭發(fā)浸入洗發(fā)劑(2mL洗發(fā)露與50mL蒸餾水混合)中自然保溫24h,觀察其是否褪色[2]。

    表1 各配方中LEM 404-a和對苯二胺的質(zhì)量分數(shù) %

    2 結(jié)果與討論

    2.1 YM404黑色素發(fā)酵條件研究

    2.1.1 碳源對生物量及黑色素產(chǎn)量的影響

    以麥芽糖作為碳源時,YM404菌株發(fā)酵液520nm處的吸光度值與生物量均最高,如圖1a所示,表明麥芽糖為YM404菌株生長及產(chǎn)黑色素的最適碳源。隨著麥芽糖質(zhì)量濃度的上升,發(fā)酵液吸光度值與生物量均呈上升趨勢,如圖1b所示,當麥芽糖質(zhì)量分數(shù)高于25g/L時,兩者均趨于穩(wěn)定,選取麥芽糖最佳質(zhì)量濃度為25g/L。

    圖1 碳源和麥芽糖對YM404生物量及黑色素產(chǎn)量的影響

    2.1.2 氮源對生物量及黑色素產(chǎn)量的影響

    氮源對YM404菌株生物量及黑色素產(chǎn)量的影響如圖2所示。

    從圖2可看出,以酵母膏作為氮源時,發(fā)酵液在520nm處吸光度值最高。而以蛋白胨作為氮源時YM404菌株生物量達最大,但吸光度值較低。由于實驗的主要目的在于提高黑色素的得率,因此以吸光度值為主要指標,選擇酵母膏作為最適氮源。隨著酵母膏質(zhì)量濃度上升,發(fā)酵液吸光度值與生物量均呈上升趨勢,當酵母膏的質(zhì)量濃度高于6g/L時,兩者均趨于穩(wěn)定,選取酵母膏最佳質(zhì)量濃度為6g/L。

    圖2 氮源及酵母膏對YM404菌株生物量及黑色素產(chǎn)量的影響

    2.1.3 L-DOPA與谷胱甘肽對YM404的影響

    研究表明,二羥基苯丙氨酸(DOPA)和谷胱甘肽為黑色素合成途徑的中間產(chǎn)物[12],在發(fā)酵液中添加L-DOPA與谷胱甘肽,可能對YM404黑色素產(chǎn)量有一定影響,如圖3所示。

    從圖3a可以看出,不添加L-DOPA的空白對照組的吸光度值為0.327,生物量為0.927g。隨著L-DOPA濃度的增加,發(fā)酵液的吸光度與生物量均呈先上升后下降趨勢,當L-DOPA的濃度為1.25mmol/L時,發(fā)酵液吸光度值達到最大,為0.557,當濃度為0.75mmol/L時,生物量最大,為1.231g。這表明添加適量的L-DOPA有益于YM404菌株生長及黑色素的積累,過量時則起抑制作用。

    圖3 L-DOPA與谷胱甘肽濃度對YM404生物量及黑色素產(chǎn)量的影響

    由圖3b可看出,不添加谷胱甘肽的空白對照組的吸光度為0.351,生物量為0.827g。隨著谷胱甘肽濃度的增加,YM404發(fā)酵液吸光度值與生物量均呈先上升后下降趨勢,當濃度為0.75mmol/L時,吸光度和生物量都達到最大。當谷胱甘肽濃度繼續(xù)增大時,吸光度值與生物量下降,表明過量添加谷胱甘肽會抑制YM404菌株生長及黑色素積累。與L-DOPA對YM404菌株生長及產(chǎn)黑色素的影響相比,添加谷胱甘肽對其影響較不顯著,因此選擇在培養(yǎng)基中添加1.25mmol/L L-DOPA。

    綜上所述,確定LEM404的最佳發(fā)酵條件如下:麥芽糖質(zhì)量濃度為30g/L,酵母膏質(zhì)量濃度為 6g/L,L-DOPA 濃 度 為 1.25mmol/L,160r/min,26℃恒溫振蕩培養(yǎng)10d。采用上述條件發(fā)酵粒毛盤菌YM404,可得LEM404的得率為3.45g/L。

    2.2 LEM404的分級分離

    LEM404經(jīng)葡聚糖G-100凝膠柱洗脫,在第1~20管內(nèi)出現(xiàn)1個吸收峰,如圖4所示,收集前20管洗脫液,經(jīng)透析、冷凍干燥后得均一性黑色素LEM404-a,其占LEM404總量的43.7%。

    圖4 LEM404葡聚糖凝膠洗脫曲線

    2.3 LEM404-a的質(zhì)譜分析

    LEM404-a質(zhì)譜如圖5所示,圖5中,[M]+、[M+H]+的準分子離子峰的質(zhì)核比分別為432.18和433.18,可確定LEM404-a的分子量為432.18。

    圖5 LEM404-a質(zhì)譜圖

    2.4 LEM404的染色效果

    各配方染發(fā)劑的染色效果見表2所列。表2表明,添加LEM404-a有助于提高染發(fā)劑的染色效果,并可減少對苯二胺的使用量;當保持對苯二胺的質(zhì)量分數(shù)不變時,增加LEM404-a的量,可獲得最佳染色效果;而僅以LEM404-a溶液作為染發(fā)劑幾乎不著色,這是由于天然黑色素較難滲透到皮層,導(dǎo)致其牢固度不理想,因此需少量添加對苯二胺作為滲透劑輔助染色[6]。

    本研究配方Ⅴ中對苯二胺的質(zhì)量分數(shù)僅為0.2%,遠低于行業(yè)標準(<6%),也低于市場上現(xiàn)有的天然染發(fā)劑中對苯二胺的平均質(zhì)量分數(shù)(約為1%)[13],表明以LEM404-a為原料制備的配方Ⅴ染發(fā)劑具有染色效果好且毒性低的優(yōu)點。

    表2 LEM404-a的染色效果

    3 結(jié) 論

    粒毛盤菌YM404產(chǎn)胞外黑色素的發(fā)酵條件為:ρ(麥芽糖)=30g/L,ρ(酵母膏)=6g/L,c(L-DOPA)=1.25mmol/L,得率為3.45g/L;LEM404經(jīng)分級分離后,獲得均一性黑色素LEM404-a,其占LEM404總量的43.7%,相對分子質(zhì)量為432.18,表明葡聚糖凝膠柱分級分離的方法可獲得黑色素均一性組分;LEM404-a本身染色效果差,但以其為原料,添加少量對苯二胺(0.2%)制備的染發(fā)劑染色效果好且毒性低,是一種安全有效的染發(fā)劑,具有廣闊的市場應(yīng)用前景。

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