24份西番蓮種質(zhì)SSR分子標(biāo)記分析

應(yīng)東山　張如蓮　王明　王琴飛++高玲++劉迪發(fā)++李莉萍

摘 要 采用SSR標(biāo)記對24份西番蓮材料的遺傳多樣性進(jìn)行研究，從45對引物組合中篩選出16對擴(kuò)增帶清晰、重復(fù)性好的引物組合。結(jié)果表明：16對SSR引物共產(chǎn)生68條擴(kuò)增帶，其中58條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率平均為85.3 %，24份材料的遺傳相似系數(shù)（GS）的范圍為0.09-1.0；UPGMA法聚類分析結(jié)果表明，24份西番蓮種質(zhì)以0.45為閾值可分為7大類，SSR標(biāo)記豐富的多態(tài)性可在西番蓮分子生物學(xué)領(lǐng)域中廣泛應(yīng)用。

關(guān)鍵詞 西番蓮 ；SSR ；種質(zhì)資源 ；遺傳多樣性

中圖分類號 Q949.759.5

西番蓮別名雞蛋果、百香果，是西番蓮科（Passifloraceae）西番蓮屬（Passiflora Linn）熱帶多年生草質(zhì)到半木質(zhì)藤本攀緣果樹，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)。西番蓮富含17種氨基酸，具有檸檬、柑、桔、橙子、菠蘿等水果香味，素有“飲料之王”、“水果味精”的美稱，是生產(chǎn)果汁飲料的重要原料和添加劑。南美洲安第斯山脈地區(qū)被認(rèn)為是西番蓮屬遺傳多樣性中心，擁有450多個種，盡管其中只有少數(shù)可食且具有香味的西番蓮被開發(fā)和商業(yè)化[1]。其中在中國有19種，當(dāng)前作為果實(shí)供食用的主要有6個種：紫果種（Passiflora edulis Sims）、黃果種（P. edulis Sim. F， flavicarpa Deg.）、樟葉西番蓮（P. laurifolia L.）、大果西番蓮（P.quadrangularis L.）、甜果西番蓮（P. ligularis Juss）、香蕉西番蓮（P. mollissima （HBK））等6類[2]。

分子標(biāo)記的應(yīng)用和發(fā)展在西番蓮商業(yè)化品種選育上具有重要的作用，分子標(biāo)記能直接從DNA水平反映種質(zhì)之間的遺傳差異，也是研究植物遺傳多樣性的有效工具。西番蓮屬自交不親和，因此通過西番蓮群體的基因流研究可解釋種群間的遺傳多樣性[1]。目前，利用SSR標(biāo)記對國內(nèi)西番蓮種質(zhì)遺傳多樣性研究方面鮮有報(bào)道，尚缺乏較系統(tǒng)、有針對性地對不同產(chǎn)地的西番蓮資源進(jìn)行分子水平上的遺傳評價(jià)與鑒定分類。本實(shí)驗(yàn)采用SSR標(biāo)記分析西番蓮遺傳多樣性，SSR標(biāo)記數(shù)量眾多，屬于共顯性遺傳，具高度多態(tài)性、重復(fù)性和穩(wěn)定性，簡便可靠，因此被廣泛地用于遺傳多樣性研究。它們豐富且均勻地分布在整個基因組中[3-4]，這使得它們適合于系譜關(guān)系的研究[5]。目前，SSR標(biāo)記已經(jīng)廣泛地應(yīng)用遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位和克隆、基因組結(jié)構(gòu)、起源進(jìn)化研究、分子標(biāo)記輔助育種等方面。本研究以24份西番蓮種質(zhì)為材料，在前期體系優(yōu)化的基礎(chǔ)上，利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)研究西番蓮資源的遺傳多樣性，以期為西番蓮種質(zhì)資源的分類、育種和資源的開發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)采用的西番蓮葉片取自中國科學(xué)院西雙版納熱帶植物園（采集地簡稱勐臘）、云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶亞熱帶經(jīng)濟(jì)作物研究所（采集地簡稱保山）、中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院熱帶作物品種資源研究所農(nóng)業(yè)部熱帶作物種子種苗質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（采集地簡稱儋州）西蓮種質(zhì)圃，詳見表1。

實(shí)驗(yàn)所用Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、標(biāo)準(zhǔn)分子量DNA（100 bp plus Marker）購自TaKaRa公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成（表2）。電泳所用主要試劑甲叉雙丙烯酰胺、丙烯酰胺、去離子甲酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺等均為國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

西番蓮總DNA提取參考Kit等[6]的改良CTAB法，通過瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的提取質(zhì)量，將DNA濃度稀釋至20 ng/μL。利用已開發(fā)的45對SSR引物，篩選出擴(kuò)增多態(tài)性好、條帶清晰的16對引物，對24份材料進(jìn)行擴(kuò)增。

PCR反應(yīng)體系為20 μL，其中包括0.2 mmol/L dNTPs、1.0 U Taq DNA聚合酶、60 ng DNA模板、0.5 μmol/L引物及10×PCR buffer（含Mg2+）。PCR進(jìn)行擴(kuò)增的程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性45 s，52-62 ℃（根據(jù)具體引物的退火溫度而定）復(fù)性1.0 min，72 ℃延伸1.0 min，32個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8 % PAGE膠進(jìn)行檢測，PAGE膠經(jīng)30 min預(yù)電泳，之后加入經(jīng)變性劑變性后的產(chǎn)物4.0 μL進(jìn)行點(diǎn)樣，75 W恒功率電泳1 h，電泳結(jié)束后銀染檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析

選擇重復(fù)性好、清晰可辨的照片進(jìn)行譜帶統(tǒng)計(jì)，依據(jù)SSR擴(kuò)增圖譜中同一位置上電泳條帶的有無統(tǒng)計(jì)建立二元矩陣表，每個引物遷移率相同的條帶記為1個位點(diǎn)，有條帶的賦值為1，無條帶的賦值為0，構(gòu)建SSR的0、1數(shù)據(jù)庫。

按照Nei等[7]的方法計(jì)算材料間的相似系數(shù)，并利用GS值按類平均法進(jìn)行遺傳相似性聚類分析和構(gòu)建聚類圖。應(yīng)用NTSYSpc-2.10版軟件，計(jì)算24份西番蓮種質(zhì)間遺傳距離或遺傳相似系數(shù)，然后根據(jù)非加權(quán)配對算術(shù)平均法（UPGMA）進(jìn)行聚類分析，構(gòu)建親緣關(guān)系聚類樹狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 遺傳多樣性分析

從45對引物組合中篩選出16對擴(kuò)增帶清晰、重復(fù)性好的引物組合，分別對24份材料的DNA進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，16對引物共產(chǎn)生68條擴(kuò)增帶，其中58條為多態(tài)性條帶，多態(tài)性條帶比率平均為85.3 %。

2.2 聚類分析

24份西番蓮資源以0.45為閾值，可分為7個類群，第Ⅰ類群包括2份種質(zhì)，來自農(nóng)業(yè)部質(zhì)檢中心儋州基地的樟葉西番蓮、Danzhou 1號；第Ⅱ類群包括1份種質(zhì)，來自儋州農(nóng)業(yè)部質(zhì)檢中心基地的雙花西番蓮；第Ⅲ類群包括1份種質(zhì)，來自中科院西雙版納熱帶植物園勐臘種質(zhì)圃的Passiflora yucatanesic；第Ⅳ類群包括15份種質(zhì)，其中來自儋州農(nóng)業(yè)部質(zhì)檢中心基地的有9份，包括Danzhou 2號、Danzhou 3號（黃果）、Danzhou 4號（紫紅果）、Danzhou 5號、Danzhou 6號（黃果）、Danzhou 7號、Danzhou 8號、Danzhou 9號、紫果西番蓮，表明分子標(biāo)記不能區(qū)分種質(zhì)的果實(shí)顏色；來自云南農(nóng)科院熱經(jīng)所保山種質(zhì)圃的有3份，包括紫果西番蓮、黃果西番蓮、泰國種；來自中科院西雙版納熱帶植物園勐臘種質(zhì)圃的有3份，包括澳A、澳B、Passiflora edulis（紫果）；第Ⅴ類群包括2份種質(zhì)，P.Coccinea和Passiflora coccinea，來自中科院西雙版納熱帶植物園勐臘種質(zhì)圃；第Ⅵ類群包括1份種質(zhì)為Passiflora faetida，來自中科院西雙版納熱帶植物園勐臘種質(zhì)圃；第Ⅶ類群包括2份種質(zhì)，大果西番蓮和Passiflora guadrangularis（大果西番蓮），分別來自云南農(nóng)科院熱經(jīng)所保山種質(zhì)圃和中科院西雙版納熱帶植物園勐臘種質(zhì)圃（圖1）。

3 討論與結(jié)論

西番蓮變異系數(shù)大，可用于一些重要農(nóng)藝性狀的、定位的天然雜交群體[1]。開展西番蓮基因流、遷移率和有效群體大小的預(yù)測對了解國內(nèi)西番蓮自然群體活力和物種生殖系統(tǒng)的研究很重要。Diana等[8]利用AFLP、SSR對來自哥倫比亞的70份材料進(jìn)行種內(nèi)變異研究；Juliana等[9]利用ISSR標(biāo)記評估改良和未經(jīng)改良的黃果西番蓮遺傳變異研究；Cerqueira-Silva1等[10]利用16條RAPD引物區(qū)分14種基因型西番蓮種質(zhì)；Eileen等[11]利用7條RAPD引物和SSR A08FP1引物對供觀賞用的3個新品種西番蓮雜種進(jìn)行確認(rèn)，擴(kuò)增得到雜合西番蓮種屬特異性片段。冷言峰[12]利用14條ISSR引物對33份西番蓮種質(zhì)進(jìn)行遺傳多樣性分析，多態(tài)位點(diǎn)比率為99.56 %，說明西番蓮種質(zhì)資源存在廣泛的遺傳變異，這與本研究結(jié)果相一致。

Danzhou 1號西番蓮葉片的葉形與樟葉西番蓮相似，葉革質(zhì)、卵狀長圓形、基部圓形、全緣、無毛、葉脈羽狀，與樟葉西番蓮的相似性系數(shù)為0.78，故其親緣關(guān)系較近。其中雙花西番蓮單獨(dú)聚為一類，在葉形、果實(shí)大小方面與黃果、紫果西番蓮相比有較大的差異，其結(jié)果在分子與形態(tài)學(xué)上有著一定程度的一致性。

大多數(shù)供試的西番蓮材料的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳相似性系數(shù)為0.09-1.0，可能由于西番蓮屬異花授粉植物，長期的開放授粉使不同基因型間基因頻繁交流，使得種質(zhì)之間存在一定的差異。種質(zhì)間的遺傳差異與材料采集地的關(guān)系不太明顯，來自云南勐臘的澳A、澳B和來自云南保山的紫果、黃果、泰國種與來自海南儋州的大部分聚為一類，這與冷言峰[12]的研究結(jié)果一致。但來自儋州地區(qū)的Danzhou 2號、Danzhou 3號、Danzhou 4號、Danzhou 5號、Danzhou 6號、Danzhou 7號、Danzhou 8號、Danzhou 9號、紫果西番蓮等大多數(shù)西番蓮聚為一類，這也表明目前儋州地區(qū)西番蓮種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)較為狹窄。其可能是該地區(qū)引進(jìn)的品種較為單一；也可能是育種者為保持其親本的的優(yōu)良性狀，采用無性繁殖的方式，而推廣優(yōu)良無性系是西番蓮繁殖的主要途徑，使得在這些種質(zhì)的某些性狀的基因趨于一致，從而導(dǎo)致后代親緣關(guān)系多數(shù)較近；還有以實(shí)生選種為主的育種過程，也是同一地區(qū)種質(zhì)的遺傳關(guān)系趨向于一致。在國內(nèi)西番蓮的研究還處于初級階段，地域之間的種質(zhì)交流不頻繁也是導(dǎo)致這一結(jié)果形成的原因。

本研究結(jié)果還發(fā)現(xiàn)黃果西番蓮和紫果西番蓮聚為一類，在分子上不能按果實(shí)顏色來區(qū)分種質(zhì)。其原因在于西番蓮種質(zhì)之間的親緣關(guān)系近，這跟國內(nèi)的一些育種現(xiàn)狀相吻合，黃果西番蓮是紫果西番蓮的突變種，其親緣關(guān)系較近，如‘占果1號、‘古楊1號均是從黃、紫果種雜交后代中選出的優(yōu)良品系[13]。

來自云南農(nóng)科院熱經(jīng)所保山種質(zhì)圃的大果西番蓮與中科院西雙版納熱帶植物園勐臘種質(zhì)圃的Passiflora guadrangularis（大果西番蓮）兩者聚為一類，表明大果西番蓮與其他品種西番蓮的差異較大，分子標(biāo)記能完全將大果種西番蓮與其他品種的西番蓮區(qū)分開來。來自中科院西雙版納熱帶植物園勐臘種質(zhì)圃P. coccinea、Passiflora coccinea聚為一類，相似性系數(shù)為0.83，親緣關(guān)系很近，可能為同一品種的不同突變株。來自儋州的紫果西番蓮與來自勐臘的Passiflora edulis（紫果）相似性系數(shù)為1，可能為同一個品種材料。

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