歐陽樂軍,沙月娥,黃真池,李莉梅,曾富華
(1.廣東石油化工學(xué)院,廣東 茂名 525000;2. 湛江師范學(xué)院,廣東 湛江 524048)
尾巨桉不同類型愈傷組織內(nèi)源激素含量差異比較
歐陽樂軍1,沙月娥2,黃真池2,李莉梅1,曾富華2
(1.廣東石油化工學(xué)院,廣東 茂名 525000;2. 湛江師范學(xué)院,廣東 湛江 524048)
本實(shí)驗(yàn)以尾巨桉無性系(DH32-29)無菌苗的莖段為外植體誘導(dǎo)得到的綠色、黃綠色、白色和褐色4種類型愈傷組織為材料。檢測不同愈傷組織中內(nèi)源激素的含量,結(jié)果顯示,綠色和黃綠色胚性愈傷組織中的IAA、ABA、6-BA含量均比白色和褐色的非胚性愈傷組織高,其中ABA的差異最大,而GA3含量則在非胚性愈傷組織中含量較高。較高含量的GA3不利于胚性愈傷組織的形成,而往培養(yǎng)基中添加適量的ABA可提高尾巨桉胚性愈傷組織的形成率及胚狀體的發(fā)生率。本研究為尾巨桉胚狀體誘導(dǎo)及分化機(jī)理提供借鑒與參考。
尾巨桉 愈傷組織 內(nèi)源激素
尾巨桉是我國種植面積最大的桉樹人工林樹種[1],其種苗培育一直通過組織培養(yǎng)擴(kuò)繁的方式進(jìn)行,但由于不定芽分化困難,再生效率不高[2]。利用體細(xì)胞胚胎發(fā)生途徑再生能增加繁殖系數(shù),提高種苗質(zhì)量,降低種苗生產(chǎn)成本。加之,尾巨桉胚性細(xì)胞繁殖快,同步性好,具有很強(qiáng)的接受外源DNA的能力,是理想的外源基因轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞。因此,胚狀體誘導(dǎo)在高效遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立、離體種子資源保存等許多方面都有廣泛的應(yīng)用,社會、經(jīng)濟(jì)及生態(tài)效益良好[3]。非胚性愈傷組織(Non-embryonic callus,NEC)細(xì)胞木質(zhì)化程度高,活力不強(qiáng),難以接受外源基因而轉(zhuǎn)化成功,也難以再生成植株。建立尾巨桉胚性愈傷組織(Embryonic callus,EC)高頻發(fā)生體系是誘導(dǎo)尾巨桉胚狀體發(fā)生的前提。
近年來,在植物胚性細(xì)胞發(fā)育及胚狀體發(fā)生過程的研究上,研究者已不僅僅局限于組織形態(tài)學(xué)上的描述,而是在此基礎(chǔ)上,結(jié)合生理生化的研究,探討體細(xì)胞胚性的啟動及胚狀體發(fā)生的生理及分子機(jī)制。胚狀體發(fā)生是體細(xì)胞脫分化進(jìn)而再分化的過程,這個過程中細(xì)胞內(nèi)源激素含量的變化與胚性愈傷組織分化形成胚狀體有緊密的相關(guān)性[4-7]。本實(shí)驗(yàn)室在前期研究工作中,通過多種植物生長調(diào)節(jié)劑的組合運(yùn)用,成功誘導(dǎo)得到尾巨桉胚性愈傷組織。本研究以尾巨桉胚性與非胚性愈傷組織為材料,通過高效液相法測定胚性愈傷組織及非胚性愈傷組織內(nèi)源激素含量的差異,可為胚狀體誘導(dǎo)及分化機(jī)理提供借鑒與參考。
采用本實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)得到的4種不同顏色尾巨桉愈傷組織為材料,其中綠色和淺黃色的高活性的為胚性愈傷組織,白色和褐色為非胚性愈傷組織[8]。
IAA(生長素)、GA3(赤霉素)、ABA(脫落酸)、6-BA標(biāo)準(zhǔn)品、PVPP(交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮)均購置上海生工,其他試劑為國產(chǎn)分析純,購置廣州化學(xué)試劑廠。
分別稱取IAA、GA3、ABA、6-BA標(biāo)準(zhǔn)樣品0.01 g,分別配制成 0.006 25、0.012 5、0.025、0.05、0.1 mg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)待測液。
2.2.1 IAA、GA3、ABA的提取
分別稱取綠色、淺黃色、白色和褐色尾巨桉愈傷組織材料各2 g,加20 mL 80%預(yù)冷的甲醇研磨,于0℃中浸提21 h(隔一段時間振蕩一下),接著離心30 min(4℃,9 500 rpm),殘渣用8 mL80%甲醇洗滌、攪勻,浸提3 h然后離心30 min(4℃,9 500 rpm),殘渣再重復(fù)浸提及離心的步驟,最后合并3次離心濾液。
2.2.2 IAA、GA3、ABA的分離
上述得到的濾液放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40℃減壓濃縮至水相。將水相在-39℃凍12 h,于4℃下解凍,離心30 min(4℃,11 600 rpm),取上清液,用 0.2 mol·L-1Na2HPO4調(diào) pH 至 8.0,然后用等體積的乙酸乙酯和石油醚萃取3次,合并酯相,同時合并水相,用2 mL pH8.0磷酸緩沖液將酯相洗滌三次,合并水相,棄去酯相。水相于40℃下濃縮除去殘余酯相,再往水相加入1 g 交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(PVPP),于5℃低溫?fù)u床中搖30 min,過濾除去PVPP,濾液用1 mol·L-1檸檬酸調(diào)pH至2.8。接著濾液用等體積的乙酸乙酯萃取3次,合并酯相,除去水相,酯相于-39℃冰凍過濾除去水分,于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中濃縮至干,最后用流動相定容至2 mL。
2.2.3 HPLC法檢測前流動相、標(biāo)樣及樣品的前處理
流動相中甲醇及0.01 mol·L-1磷酸分別經(jīng)過有機(jī)相濾膜和水系濾膜進(jìn)行抽濾,抽濾結(jié)束后超聲30 min。
不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品用0.45 μm孔徑濾膜過濾,用1.5 mL收集瓶收集,用振蕩器震蕩50 s。
2.2.4 HPLC法檢測IAA、GA3、ABA含量
樣品的檢測在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所進(jìn)行。色譜分離條件為:流動相︰甲醇︰ 0.01 mol·L-1H3PO4=42︰ 58(V ︰ V);流速:1 mL·min-1;檢測波長:218 nm、265 nm、210 nm;進(jìn)樣量:15 μL。IAA、GA3、ABA各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和各種愈傷組織樣品溶液進(jìn)樣檢測,記錄數(shù)據(jù)。
2.3.1 6-BA的提取
分別稱取綠色、白色、黃色及褐色愈傷組織材料各2 g,提取方法同2.2.1。
2.3.2 6-BA的分離
將得到的濾液放在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上于40℃減壓濃縮至水相。將水相在-39℃凍12 h,然后于4℃下解凍,離心30 min(4℃,11 600 rpm),取上清液。上清液用1 mol·L-1檸檬酸調(diào)pH至3.0,接著用等體積石油醚和乙酸乙酯萃取3次,棄去酯相,水相40℃濃縮除去殘余酯相。往水相加入0.5 g PVPP,于5℃搖床中搖30 min,過濾,除去PVPP,再用 0.2 mol·L-1Na2HPO4調(diào) pH 至 8.0,加入等體積乙酸乙酯萃取3次,黑暗條件下,酯相于蒸發(fā)皿中60℃水浴蒸干。用流動相將殘質(zhì)洗脫下來,定容到2 mL。
2.3.3 HPLC法檢測前流動相、標(biāo)樣及樣品的前處理
流動相中甲醇及1%冰醋酸分別經(jīng)過有機(jī)相濾膜和水系濾膜進(jìn)行抽濾,抽濾結(jié)束后于超聲儀中超聲30 min。
不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品及樣品用0.45 μm孔徑濾膜過濾后用收集瓶收集,震蕩50 s用作待測液。
2.3.4 6-BA含量檢測
樣品的檢測在中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所進(jìn)行。色譜分離條件為:流動相︰甲醇︰1%冰醋酸=40︰60(V︰V);流速:1 mL·min-1;檢測波長:210 nm;進(jìn)樣量:15 μL。6-BA各種濃度的標(biāo)準(zhǔn)液和各種愈傷組織樣品溶液進(jìn)樣檢測,記錄數(shù)據(jù)。
根據(jù)不同濃度標(biāo)準(zhǔn)品出峰規(guī)律,找出物質(zhì)峰,確定該物質(zhì)的保留時間,IAA、GA3、ABA的保留時間分別為:7.850 2±0.020 9、5.183 2±0.010 5、13.397 2±0.016 5(IAA、GA3、ABA標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1A、B、C)。以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),將所得數(shù)據(jù)繪制IAA、GA3、ABA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示,IAA線性方程為y =2E + 08x-95 391(R2=0.999 9),GA3線性方程為y =1E + 07x +1 993.9(R2=0.999 9),ABA線性方程為y= 8E + 07x-45 880(R2=0.999 8)。
圖1 0.05 mg·L-1標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖Fig.1 Chromatogram of 0.05 mg·L-1 standard samples
圖2 標(biāo)準(zhǔn)品的標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of standard samples
表明 IAA、GA3、ABA 在 0.006 25 ~ 0.1 mg·mL-1濃度范圍內(nèi)均與吸收峰面積線性關(guān)系良好。
根據(jù)不同濃度6-BA標(biāo)準(zhǔn)品出峰規(guī)律,找出6-BA物質(zhì)峰,確定6-BA的保留時間,6-BA的保留時間為:2.3458±0.0033(6-BA標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖見圖1D)以標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積為縱坐標(biāo),將所得數(shù)據(jù)繪制6-BA標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖2所示,6-BA線性方程為y = 5E+07x-174 638(R2=0.993 1),線性范圍為 0.006 25 ~ 0.1 mg·mL-1。
3.2.1 4種愈傷組織IAA含量的比較
4種愈傷組織的IAA色譜圖見圖3,通過色譜圖中IAA物質(zhì)峰面積計算4種愈傷組織中IAA含量,得到綠色愈傷組織IAA含量最高為714.73 ng·g-1,其次是淺黃色愈傷組織,其IAA含量為622.18 ng·g-1,白色及褐色愈傷組織IAA含量較低,分別為491.03、484.76 ng·g-1(圖4)。由此可看出,胚性愈傷組織比非胚性愈傷組織中IAA含量高。
圖3 IAA在218 nm通道下色圖譜Fig.3 Chromatogram of IAA in 218 nm
圖 4 不同類型愈傷組織中IAA含量差異Fig.4 Difference of IAA content in different types of calli
3.2.2 4種愈傷組織GA3含量的比較
4種愈傷組織的GA3色譜圖見圖5,通過色譜圖中GA3物質(zhì)峰面積計算4種愈傷組織中GA3含量,發(fā)現(xiàn)4種愈傷組織中褐色愈傷組織GA3含量最高,達(dá)到3.99 mg·g-1,其次是白色愈傷組織,綠色愈傷組織中GA3含量最低,也就是非胚性愈傷組織中GA3含量比胚性愈傷組織中高(圖6所示)。
3.2.3 4種愈傷組織ABA含量的比較
4種愈傷組織的ABA色譜圖見圖7,通過色譜圖中ABA物質(zhì)峰面積計算4種愈傷組織中ABA含量,發(fā)現(xiàn)4種愈傷組織中ABA水平比IAA水平高,但比GA3水平低得多。其中綠色愈傷組織ABA含量最高,淺黃色愈傷組織中ABA含量是綠色愈傷組織的0.5倍,而褐色愈傷組織中ABA含量最低,不到綠色愈傷組織的1/4,差異達(dá)到極顯著水平。由此可知胚性愈傷組織中ABA含量比非胚性愈傷組織中高(圖8所示)。
圖5 GA3 在210 nm通道下色譜圖Fig.5 Chromatogram of GA3 in 210 nm
圖6 不同類型愈傷組織中GA3含量差異Fig.6 Difference of GA3 content in different types of calli
3.2.4 樣品中6-BA含量測定
4種愈傷組織的6-BA色譜圖見圖9,圖中顯示,210 nm下白色愈傷組織和褐色愈傷組織樣品的雜峰比較多。通過色譜圖中6-BA物質(zhì)峰面積計算4種愈傷組織中6-BA含量,發(fā)現(xiàn)4種愈傷組織中6-BA水平比IAA、ABA水平高,但比GA3水平低。其中淺黃色愈傷組織含量最高,其他3種愈傷組織含量相近,但總體來說,胚性愈傷組織中6-BA含量比非胚性中的高(圖10所示)。
圖7 ABA 在265 nm通道下色譜圖Fig.7 Chromatogram of ABA in 265 nm
圖8 不同類型愈傷組織中ABA含量差異Fig.8 Difference of ABA content in different types of calli
胚狀體形成及胚性愈傷組織分化是一個極為復(fù)雜的生理生化和形態(tài)發(fā)生過程,是植物體內(nèi)各種因素共同作用、相互協(xié)調(diào)的結(jié)果,期間各類植物激素發(fā)揮不同作用,同時呈現(xiàn)一定的變化規(guī)律[9-12]。
本研究檢測了胚性愈傷組織與非胚性愈傷組織中內(nèi)源激素含量,通過比較發(fā)現(xiàn),胚性愈傷組織中IAA、ABA含量比非胚性愈傷組織中的高,而GA3則相反。賴鐘雄等[13]在龍眼胚狀體內(nèi)源激素變化的研究中發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織中內(nèi)源IAA水平大大高于非胚性愈傷組織,因此其推測相對高水平的內(nèi)源IAA含量是誘導(dǎo)和維持胚性細(xì)胞的基礎(chǔ)。本研究結(jié)果與其相類似。
生長素用于啟動細(xì)胞分裂及其胚性潛力的誘導(dǎo),本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)胚性愈傷組織中IAA含量相對較高,細(xì)胞分裂素類物質(zhì)一般被認(rèn)為不是啟動胚性必需的,但是在某些植物上,這類物質(zhì)對其胚狀體的發(fā)生也起著關(guān)鍵的作用,生長素與細(xì)胞分裂素的適當(dāng)組合能有效誘導(dǎo)胚狀體的發(fā)生。內(nèi)源脫落酸與體細(xì)胞胚性能力的啟動或者表達(dá)相關(guān),本研究發(fā)現(xiàn)胚性與非胚性愈傷組織中ABA含量差異較明顯。張媛媛[14]等人的研究表明,ABA在植物體細(xì)胞胚形成期逐漸上升,并且ABA∶IAA相對比值在此階段仍然處于較高水平,高ABA∶IAA比值有利于體細(xì)胞胚的形成,這與本研究結(jié)論相一致。
愈傷組織中的色素會干擾激素的檢測,不同顏色的愈傷組織中含有的色素也不一樣,因此給內(nèi)源激素的檢測帶來難度[15]。本實(shí)驗(yàn)中利用的脫色劑為石油醚,但是樣品即使研磨得很細(xì),脫色后仍然有微小的愈傷組織顆粒,結(jié)合在這些小顆粒上的色素難以清除干凈。這可能就導(dǎo)致了在ABA、6-BA檢測時出現(xiàn)很多雜峰。而且愈傷組織中內(nèi)源激素含量與愈傷組織的選擇等外界條件有很大的關(guān)系,同時也與測定時的流動相、流速和檢測波長有關(guān),而且合適的內(nèi)源激素提取方法的選擇和色譜條件也較為重要。對于尾巨桉愈傷組織誘導(dǎo)中,外源激素處理與內(nèi)源激素含量變化間的相關(guān)性以及愈傷組織分化不同階段中內(nèi)源激素含量變化規(guī)律還有待進(jìn)一步研究。
圖9 6-BA 在210 nm通道下色譜圖Fig.9 Chromatogram of 6-BA in 210 nm
圖10 不同類型愈傷組織中6-BA含量差異Fig.10 Difference of 6-BA content in different types of calli
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Study on Difference of Callus of Eucalyptus urophylla × Eucalyptus grandis
OUYANG Le-jun1, SHA Yue-e2, HUANG Zhen-chi2, LI Li-mei1, ZENG Fu-hua2
(1. Guangdong University of Petrochemical Technology, Maoming 525000, Guangdong, China; 2. Zhanjiang Normal University,Zhanjiang 524048, Guangdong, China)
Hypocotyls excised from Europhylla formed callus.Then later, the callus differentiated into 4 types, including brown callus,green callus, yellowish green and white callus.The levels of endogenous phytohormones were detected by HPLC. The result showed the contents of IAA、ABA and 6-BA in embryogenic calli were higher than those in non-embryogenic calli while the content of GA3was higher in non-embryogenic calli. GA3may deteriorate the capacity of calli to differentiate. The addition of ABA was benef i cial for embryogenic callus induction and somatic embryogenesis. With this work we lay the foundation for the eff i cient somatic embryogenesis in E. urophylla × E. grandis.
Eucalyptus urophylla×Eucalyptus grandis; Callus; endogenous phytohormones
S718.46
A
1673-923X(2014)12-0071-07
2013-12-13
國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(31470677);廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目(S2013040014690,S2012010008737);廣東省科技計劃項(xiàng)目(2012A020602108)
歐陽樂軍,男,博士,研究方向?yàn)榱帜窘M織培養(yǎng)與生物技術(shù)研究;E-mail:ljouyang@zhjnc.edu.cn
[本文編校:吳 彬]