當(dāng)歸愈傷組織培養(yǎng)研究

蔡子平 ，王國祥 ，王宏霞

（1.甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院中藥材研究所，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，甘肅 蘭州730070；3.甘肅省中藥材種質(zhì)改良與質(zhì)量控制工程實驗室，甘肅 蘭州 730070）

當(dāng)歸［Angelica sinensis（Oliv.）Diels］為傘形科多年生草本植物，以干燥根入藥，具有補血活血、調(diào)經(jīng)止痛、潤腸通便等功效，素有“十方九歸”之稱［1］。其主產(chǎn)于甘肅、云南、四川、陜西、青海等省，尤以甘肅岷縣當(dāng)歸為最佳［2］。近年來，隨著中藥產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，當(dāng)歸已在美容保健、飲品、調(diào)味品等行業(yè)中廣泛應(yīng)用，市場需求量也越來越大，種植當(dāng)歸已成為甘肅當(dāng)歸主產(chǎn)區(qū)的支柱產(chǎn)業(yè)之一［3］。

當(dāng)歸是一種適宜高海拔育苗、低海拔引種移栽的特殊植物。長期以來，利用傳統(tǒng)開墾生地育苗的方法，既破壞天然植被，造成嚴重的水土流失，導(dǎo)致環(huán)境惡化，又因當(dāng)歸種子的生產(chǎn)周期長，繁殖系數(shù)低，育苗成本高。加之近年來由于氣溫升高，原適宜區(qū)的適宜性下降，其育苗所需的高海拔荒地也越來越少，優(yōu)質(zhì)當(dāng)歸種苗已成為限制當(dāng)歸生產(chǎn)的瓶頸［4］。目前，生產(chǎn)中由于品種混雜嚴重，種苗質(zhì)量良莠不齊，導(dǎo)致早期抽苔現(xiàn)象嚴重，影響到當(dāng)歸的產(chǎn)量和品質(zhì)。隨著生物技術(shù)的發(fā)展，組織培養(yǎng)技術(shù)在作物品種改良方面發(fā)揮了突出的作用，也為解決當(dāng)歸種子、種苗質(zhì)量提供了一條新途徑［5～8］。

1 材料與方法

1.1 材料

當(dāng)歸無菌苗培養(yǎng)材料為甘肅岷縣茶埠鄉(xiāng)當(dāng)年采集的新鮮種子，分去翅和不去翅兩種。

1.2 方法

1.2.1 種子預(yù)處理 先將作為培養(yǎng)材料的去翅和不去翅的當(dāng)歸種子用自來水沖洗1遍，再加入洗滌劑清洗，然后用自來水沖洗干凈，在超凈工作臺上用75%乙醇浸泡10 s，用無菌水沖洗2～3遍，再用1 g/kg的升汞溶液浸泡6 min，最后用無菌水沖洗3～4次備用。

1.2.2 無菌苗培養(yǎng) 在無菌條件下，將經(jīng)消毒處理的兩種當(dāng)歸種子分別接種于MS、1/2MS和自制瓊脂培養(yǎng)基（瓊脂與水比例為1∶200）3種培養(yǎng)基中培養(yǎng)。每處理20瓶，每瓶4粒。每天進行觀察，20 d后統(tǒng)計種子發(fā)芽率及污染率。

1.2.3 愈傷組織誘導(dǎo)及外植體篩選 種子培養(yǎng)20 d，待苗長到真葉抽出后，分別以子葉、真葉、葉柄及根為外植體，在無菌條件下，分別將子葉、真葉、葉柄及根切成0.5～1.0 cm的小塊，接種于H+0.5 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基中進行愈傷組織誘導(dǎo)，篩選最佳外植體。每處理24瓶，每瓶3塊。每天觀察生長情況，20 d后統(tǒng)計誘導(dǎo)率。

1.2.4 初代培養(yǎng) 將篩選出的最佳外植體轉(zhuǎn)接到以H、MS和1/2MS為基本培養(yǎng)基，并添加0.5 mg/L 2，4-D的培養(yǎng)基上進行愈傷組織誘導(dǎo)。每處理16瓶，每瓶3塊。每天觀察生長情況，20 d后統(tǒng)計誘導(dǎo)率。

1.2.5 繼代培養(yǎng) 15 d后將初代培養(yǎng)誘導(dǎo)出的愈傷組織再切成小塊，轉(zhuǎn)接到以H為基本培養(yǎng)基，分別添加0.5、1.0、2.0 mg/L 2，4-D和0、0.5、1.0 mg/L IAA的繼代培養(yǎng)基中培養(yǎng)，以便獲得更多的愈傷組織。每處理16瓶，每瓶3塊。每天觀察統(tǒng)計生長情況。

1.3 培養(yǎng)條件

培養(yǎng)室溫度為（25±2）℃，光照強度為1 500～1 800 Lx，光照 12 h/d。

1.4 統(tǒng)計分析方法

有關(guān)的試驗數(shù)據(jù)均采用DPS和Excel軟件進行統(tǒng)計分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)基對無菌苗培養(yǎng)的影響

從表1可以看出，去翅種子和不去翅種子的發(fā)芽率均以自制瓊脂培養(yǎng)基中最高，分別為79.0%和87.5%，但其污染率也分別達到最高值76.3%和85.0%；其次是在1/2 MS培養(yǎng)基中，發(fā)芽率分別為55.4%和68.6%，且污染率均最低，分別為6.5%和11.6%；在MS培養(yǎng)基中的發(fā)芽率相對較低，分別為29.1%和40.5%，但污染率均較高，分別為13.2%和14.3%。可見，在同一培養(yǎng)基中，不去翅種子的發(fā)芽率明顯高于去翅種子，但其污染率也相應(yīng)較高。綜合來看，當(dāng)歸無菌苗培養(yǎng)時，以去翅種子在1/2 MS培養(yǎng)基中的培養(yǎng)效果最好。

表1 不同培養(yǎng)基中當(dāng)歸種子的發(fā)芽率及污染率

2.2 不同外植體對愈傷組織誘導(dǎo)的影響

觀察結(jié)果表明，接種5 d后，子葉、葉柄的邊緣均開始膨脹。隨著培養(yǎng)時間的延長，葉柄的周圍開始出現(xiàn)大量顆粒狀、白色愈傷組織，且生長旺盛；子葉膨大明顯，在其周圍傷口處出現(xiàn)少量顆粒狀愈傷組織，但容易褐化；葉片膨大不明顯，傷口處慢慢褐化，直至最后葉片全部黃化；根基本沒有變化。從表2可以看出，葉柄的誘導(dǎo)率最高，達91.32%，且愈傷組織生長旺盛，色澤亮；子葉誘導(dǎo)率雖在80%以上，但容易老化、褐變；葉片的誘導(dǎo)率僅為18.06%。因此，當(dāng)歸愈傷組織誘導(dǎo)時，以葉柄作為外植體最適宜。

表2 不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率

2.3 不同培養(yǎng)基對葉柄愈傷組織誘導(dǎo)的影響

從表3可以看出，各處理均能較好的對葉柄誘導(dǎo)出愈傷組織，其中以H+0.5 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率最高，達89.58%±13.01%，且愈傷組織數(shù)量多，顏色淡黃，生長旺盛；MS+0.5 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基雖能誘導(dǎo)出愈傷組織，但愈傷組織極褐化嚴重；1/2 MS+0.5 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基的誘導(dǎo)率相對較低，誘導(dǎo)效果次于H+0.5 mg/L 2，4-D培養(yǎng)基。即H培養(yǎng)基為當(dāng)歸誘導(dǎo)愈傷組織的適宜基本培養(yǎng)基，H+0.5mg/L 2，4-D的誘導(dǎo)效果較好。

表4 繼代培養(yǎng)誘導(dǎo)效果

表3 不同培養(yǎng)基對葉柄愈傷組織的誘導(dǎo)效果

2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑對繼代培養(yǎng)的影響

由表4可以看出，在H培養(yǎng)基中僅添加2，4-D時，隨著2，4-D濃度的增加，出愈率逐漸降低，愈傷組織均無增殖現(xiàn)象；2，4-D濃度為0.5 mg/L時出愈率最高，達97.92%；2，4-D濃度為2.0 mg/L時誘導(dǎo)出的愈傷組織極容易褐化。同時添加2，4-D和IAA時，在IAA濃度為0.5 mg/L條件下，隨著2，4-D濃度的增加，出愈率逐漸降低，以2，4-D濃度為0.5、1.0 mg/L時的愈傷組織均增殖明顯，生長旺盛；在IAA濃度為1.0 mg/L條件下，隨著2，4-D濃度的增加，出愈率呈先增加再降低趨勢，以2，4-D濃度為0.5 mg/L時的愈傷組織均增殖明顯，生長旺盛。由此可見，只有低濃度的2，4-D配合較高濃度的IAA才可產(chǎn)生大量的顆粒狀愈傷組織，而高濃度的2，4-D對愈傷組織的增殖有抑制作用。以H+0.5 mg/L 2，4-D誘導(dǎo)愈傷組織效果最好，出愈率達90%以上；以H+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/LIAA增殖效果最好。

3 小結(jié)與討論

1）試驗結(jié)果表明，種子去翅后在1/2 MS培養(yǎng)基上培養(yǎng)是獲得當(dāng)歸無菌苗的最佳條件，此時發(fā)芽率達55.4%，污染率僅為6.5%。葉柄為當(dāng)歸愈傷組織誘導(dǎo)的最佳外植體，H培養(yǎng)基為當(dāng)歸誘導(dǎo)愈傷組織的適宜基本培養(yǎng)基。誘導(dǎo)愈傷組織培養(yǎng)基為H+0.5 mg/L 2，4-D時，出愈率達90%以上；繼代增殖培養(yǎng)基為H+0.5 mg/L 2，4-D+1.0 mg/L IAA的增殖效果較好。

2）當(dāng)歸種子去翅后滅菌更徹底，可極大地降低污染率。選擇無菌苗培養(yǎng)基時，在水+瓊脂培養(yǎng)基上當(dāng)歸種子萌發(fā)率較高，但污染率也很高，其原因有待于進一步研究。組織培養(yǎng)中通常以莖尖或莖段作為外植體進行愈傷組織的誘導(dǎo)，但從當(dāng)歸愈傷組織誘導(dǎo)結(jié)果來看，葉柄是最好的誘導(dǎo)材料，這與張俊蓮的結(jié)論相似，且材料易得，培養(yǎng)效率也較高［9］。實驗中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)歸愈傷組織在培養(yǎng)過程中極易出現(xiàn)褐化，可能與選用的激素及培養(yǎng)的時間有關(guān)，所以在后續(xù)的研究中應(yīng)繼續(xù)優(yōu)化激素配比，在繼代增殖的過程中要勤轉(zhuǎn)接，盡量減少在同一瓶培養(yǎng)基中的培養(yǎng)時間。

［1］ 國家藥典編委會.中華人民共和國藥典（2010版一部）［M］.中國醫(yī)藥科技出版社，2010：124-125.

［2］ 孔令武，孫海峰.現(xiàn)代實用中藥栽培養(yǎng)殖技術(shù)［M］.人民衛(wèi)生出版社，2000：202-205.

［3］ 魚亞瓊，邱黛玉，藺海明，等.外源激素和種苗大小對當(dāng)歸成藥期生理變化的影響［J］.湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011（9）：41-44.

［4］ 武延安，劉效瑞，曹占鳳，等.日光溫室冬季育苗抑制當(dāng)歸早期抽薹的效應(yīng)研究［J］.中國中藥雜志，2005，35（3）：283-284.

［5］ 張世瑜，鄭國昌.當(dāng)歸愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生［J］.植物學(xué)報，1982，24（6）：512-518.

［6］ 張順培，賈敬芬，李浩日，等.當(dāng)歸原生質(zhì)體的分離培養(yǎng)和愈傷組織的形成［J］.科學(xué)通報，1985（18）：1 423-1 425.

［7］ 張世瑜，鄭國昌.當(dāng)歸胚性愈傷組織的誘導(dǎo)及胚狀體發(fā)生的組織細胞學(xué)研究田［J］.植物學(xué)報，1986，28（3）：241-244.

［8］ 張俊蓮，米受恩，欒文舉.當(dāng)歸愈傷組織產(chǎn)生的影響因素分析［J］.甘肅農(nóng)業(yè)科技，1995（11）：8-10.

［9］ 張俊蓮.當(dāng)歸愈傷組織的再分化及植株再生［J］.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，1995，12（3）：293-297.