粘質(zhì)沙雷氏菌馬來酸順反異構(gòu)酶表達(dá)純化及酶學(xué)性質(zhì)

王 亞 ， 崔文璟 ， 周 麗 ， 劉中美 ， 周哲敏 *

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

富馬酸（Fumaric acid），又稱反丁烯二酸、延胡索酸，是一種天然存在的有機(jī)酸[1]。作為一種重要的四碳平臺化合物和精細(xì)化工產(chǎn)品[2]，富馬酸廣泛用于食品、醫(yī)藥、化工、涂料、增塑劑等領(lǐng)域[3]。如在食品方面，可用作口味純正的酸味劑、風(fēng)味增強(qiáng)劑。在醫(yī)藥方面，可以用于生產(chǎn)解毒藥二巰基丁二酸鈉等，富馬酸鐵則廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)上治療人體的小紅血球貧血病。工業(yè)級富馬酸主要用于生產(chǎn)不飽和聚酯樹脂和醇酸樹脂，以及用作生產(chǎn)電泳漆。另外，富馬酸可以通過生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)一些具有其他工業(yè)用途的重要化合物原料，如L-天冬氨酸、L-丙氨酸和L-蘋果酸等。目前，富馬酸的生產(chǎn)大都通過石化方法由馬來酸酐制備得到，然而化學(xué)合成法存在成本高、副產(chǎn)物多及可能造成的環(huán)境污染等問題，這使得人們的目光逐漸轉(zhuǎn)向環(huán)境友好的生物法來制備富馬酸[1]。生物轉(zhuǎn)化法多由固定化菌體細(xì)胞催化[4]，此法會(huì)使產(chǎn)物富馬酸（重要的三羧酸循環(huán)中間代謝產(chǎn)物）被菌體本身代謝轉(zhuǎn)化成其他副產(chǎn)物，造成轉(zhuǎn)化率降低，而酶法轉(zhuǎn)化則可以有效地解決這個(gè)問題。作者本研究發(fā)現(xiàn)，馬來酸順反異構(gòu)酶幾乎可以將底物馬來酸完全轉(zhuǎn)化為富馬酸，這為生物酶法工業(yè)化制備高純度富馬酸提供了有利的科學(xué)依據(jù)。

馬來酸順反異構(gòu)酶 （EC 5.2.1.1，Maleate cistrans Isomerase，MaiA）是一種能夠?qū)ⅠR來酸（順丁烯二酸）催化轉(zhuǎn)化成富馬酸（反丁烯二酸）的異構(gòu)酶，能夠在碳碳雙鍵不斷裂的情況下，實(shí)現(xiàn)順式丁烯二酸向反式丁烯二酸的異構(gòu)化，屬于天冬氨酸、谷氨酸消旋酶超家族[6]。由于具有催化反應(yīng)pH范圍寬泛、較低的Km值以及較高平衡常數(shù)的特點(diǎn)，馬來酸順反異構(gòu)酶被認(rèn)為是可用于工業(yè)生產(chǎn)富馬酸的有潛力的生物催化劑之一[7]。馬來酸順反異構(gòu)酶廣泛存在于一些可吸收利用馬來酸的細(xì)菌中，如假單胞菌屬（Pseudomonas）、產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）、沙雷氏菌屬（Serratia）、變形桿菌屬（Proteus）和節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）等。但多數(shù)馬來酸代謝菌中此酶的活力較低、熱穩(wěn)定性較差，制約了馬來酸順反異構(gòu)酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用[8]。

粘質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）來源的馬來酸順反異構(gòu)酶在室溫有較好的熱穩(wěn)定性，酶活力也相對其他菌株來源的要高[7]。但是，關(guān)于S.marcescens來源的馬來酸順反異構(gòu)酶，尚無高效表達(dá)和制備以及詳細(xì)的酶學(xué)性質(zhì)方面的報(bào)道。本研究實(shí)現(xiàn)了S.marcescens來源的馬來酸順反異構(gòu)酶在大腸桿菌中的高效表達(dá)，并對重組酶進(jìn)行了分離純化及酶學(xué)性質(zhì)等研究。在此基礎(chǔ)上，研究了馬來酸濃度對反應(yīng)速度的影響以及不同濃度的馬來酸完全轉(zhuǎn)化為富馬酸的反應(yīng)時(shí)間，為馬來酸順反異構(gòu)酶的工業(yè)化應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)和理論支持。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒 粘質(zhì)沙雷氏菌S.marcescens：NITE Biological Resource Center （NBRC）；Escherichia coli BL21（DE3），質(zhì)粒載體 pET24a（+）：Novagen公司產(chǎn)品。

1.1.2 主要試劑與儀器 Pfu DNA聚合酶、各種限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶等：日本寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；基因組DNA提取試劑盒、質(zhì)粒DNA提取試劑盒、膠回收試劑盒和PCR產(chǎn)物純化試劑盒：上海生物工程公司；AKTA蛋白純化系統(tǒng)：通用電氣醫(yī)療器械集團(tuán)產(chǎn)品；His Trap FF crude鎳柱：通用電氣醫(yī)療器械集團(tuán)產(chǎn)品。

1.1.3 引物設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)Kazuhisa等人[8]關(guān)于S.marcescens馬來酸順反異構(gòu)酶報(bào)道的基因序列設(shè)計(jì)引物。分別在上游引入EcoRⅠ酶切位點(diǎn)和保護(hù)堿基，下游引入HindⅢ酶切位點(diǎn)，在C端表達(dá)His標(biāo)簽。試驗(yàn)中所用到的引物由上海生物工程公司合成。引物序列為（劃線部分分別為EcoRⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)）：

P1：5'-CCGGAATTCATGAGCAACCACTACCGC A-3'；

P2：5'-CCCAAGCTTATAAGCGCCGGACAG-3'。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 MaiA基因的克隆 以S.marcescens的基因組DNA為模板，以P1、P2為引物PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增條件如下：94℃預(yù)變性10 min；94℃變性90 s，68 ℃退火 25 s，72℃延伸 1 min，25個(gè)循環(huán)；10 ℃保溫。

1.2.2 馬來酸順反異構(gòu)酶表達(dá)載體的構(gòu)建 將PCR擴(kuò)增到的MaiA基因產(chǎn)物用EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，連接到用同樣限制性內(nèi)切酶酶切的質(zhì)粒載體 pET24a（+）上，獲得重組質(zhì)粒 pET24a-MaiA。

1.2.3 重組蛋白MaiA的誘導(dǎo)表達(dá) 將重組質(zhì)粒pET24a-MaiA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21（DE3），獲得馬來酸順反異構(gòu)酶表達(dá)型重組大腸桿菌BL21（pET24a-MaiA）。挑取 BL21（pET24a-MaiA）平板單菌落，接種于5 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min振蕩過夜培養(yǎng)。將500 μL上述過夜培養(yǎng)物接種于50 mL含50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min振蕩培養(yǎng)至菌液OD600達(dá)到 0.8，加入IPTG 至終濃度 0.2 mmol/L，20℃誘導(dǎo)培養(yǎng)20 h，收集菌體超聲破碎，通過SDSPAGE分析鑒定重組蛋白。

1.2.4 MaiA重組蛋白的純化 將重組菌體溶于結(jié)合緩沖溶液（10 mmol/L Na2HPO4·12H2O、10 mmol/L NaH2PO4·2H2O、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L Imidazole），超聲破碎，離心，上清液用 0.22 μm 濾膜過濾。用10倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液平衡1 mL的His Trap FF crude柱子，取60 mL的樣品上樣，用20倍柱體積的結(jié)合緩沖溶液洗去非特異性吸附的蛋白質(zhì)，分別用100、300、500 mmol/L咪唑的緩沖液來洗脫蛋白質(zhì)，每個(gè)濃度梯度用10倍的柱體積洗脫，收集洗脫峰后，SDS-PAGE鑒定純化結(jié)果。

1.2.5 蛋白質(zhì)濃度的測定 蛋白質(zhì)定量采用常規(guī)的 Bradford 法[10]。

1.2.6 MaiA重組蛋白的活性測定 取450 μL用pH 8.4反應(yīng)緩沖溶液適當(dāng)稀釋的酶液，加入50 μL、1 mol/L馬來酸（KOH調(diào)至pH 8.4）溶液，37℃反應(yīng)20 min，經(jīng)0.45 μm有機(jī)濾膜過濾后，產(chǎn)物富馬酸用HPLC進(jìn)行測定[11]。

為了能夠準(zhǔn)確測定馬來酸順反異構(gòu)酶的活力，作者結(jié)合文獻(xiàn)[11]報(bào)導(dǎo)，改進(jìn)了HPLC流動(dòng)相中有機(jī)相與無機(jī)相的配比及pH值。HPLC色譜柱為La Chrom C18（5 μm 4.6×250 mm）；流動(dòng)相為體積分?jǐn)?shù)8%的甲醇水溶液，流速0.6 mL/min；UV檢測器檢測波長為210 nm，柱溫為30℃。在該條件下，馬來酸與富馬酸得以完全分離開，見圖1。

圖1 馬來酸和富馬酸混合標(biāo)樣HPLC色譜圖Fig.1 Separation of maleate and fumarate by HPLC

馬來酸順反異構(gòu)酶酶活定義：在37℃、pH 8.4的條件下，每分鐘轉(zhuǎn)化底物馬來酸生成1 μmol產(chǎn)物富馬酸所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位1 U。

1.2.7 馬來酸順反異構(gòu)酶的酶學(xué)性質(zhì)研究

1)相對酶活力的定義：以在37℃時(shí)測得的酶活力為分母，得到各個(gè)溫度下測定的相對酶活。

2)最適溫度的測定： 分別于 15、25、35、45、55、65℃下測定馬來酸順反異構(gòu)酶的活性，并以MaiA的相對酶活對溫度作圖。

3)最適pH值的測定：分別于pH 3.6、4.0、5.0、5.9、7.0、8.0、9.2、9.5、10.0、10.6 條件下測定馬來酸順反異構(gòu)酶的活性，并以MaiA的相對酶活對pH值作圖。pH 3.6、4.0、5.0采用的緩沖溶液為50.0 mmol/L NaAc-HAc，pH 5.0、6.0、7.0、8.0 和 9.2 采用的緩沖溶液為 50.0 mmol/L NaHPO4-KH2PO4，pH 9.2、9.5、10.0、10.6采用的緩沖溶液為50.0 mmol/L Na2CO3-NaHCO3。

4)熱穩(wěn)定性的測定：置馬來酸順反異構(gòu)酶于55℃和60℃水浴保溫，每隔30 min取樣終止反應(yīng)，檢測酶活，共檢測3 h，并以相對酶活的百分比對保溫時(shí)間作圖。

5)底物對馬來酸順反異構(gòu)酶催化效率的影響及轉(zhuǎn)化時(shí)間的測定：置馬來酸順反異構(gòu)酶于不同底物濃度下反應(yīng)，測定初始反應(yīng)速度并測定完全轉(zhuǎn)化底物所需的時(shí)間。

6)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)參數(shù)的測定：在37℃、pH 8.4條件下，純酶液與不同濃度的底物馬來酸（終濃度10、20、30、40 mmol/L）反應(yīng)，測定其酶反應(yīng)的初始速度，以雙倒數(shù)作圖法確定Km和kcat。

2 結(jié)果與討論

2.1 馬來酸順反異構(gòu)酶基因的克隆

用引物P1和P2，從粘質(zhì)沙雷氏菌基因組中PCR擴(kuò)增得到目的基因片段，該基因克隆于pET24a載體中，重組質(zhì)粒pET24a-MaiA經(jīng)EcoRⅠ和HindⅢ雙酶切，得到了大小為753 bp的目的條帶，見圖2，表明外源基因已經(jīng)成功連接到表達(dá)載體上。

2.2 馬來酸順反異構(gòu)酶在大腸桿菌中的誘導(dǎo)表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET24a-MaiA轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coli BL21（DE3），獲得重組大腸桿菌 BL21（pET24a-MaiA）。經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)后，SDS-PAGE電泳獲得28 000左右的電泳條帶，見圖3泳道2所示，與MaiA預(yù)期的理論相對分子質(zhì)量大小相符（其C端含有His標(biāo)簽，大小約為28 400），表明MaiA重組蛋白在大腸桿菌中實(shí)現(xiàn)了成功表達(dá)。

圖2 pET24a-MaiA質(zhì)粒雙酶切驗(yàn)證電泳圖Fig.2 Identification of MaiA by enzyme digestion

圖3 重組MaiA的表達(dá)與純化過程的SDS-PAGEFig.3 Expression and purifcation of MaiA in E.coli.

2.3 馬來酸順反異構(gòu)酶的分離純化

馬來酸順反異構(gòu)重組酶經(jīng)His Trap FF crude鎳柱純化后SDS-PAGE電泳分析結(jié)果見圖3。表明一步純化獲得了較純的目的蛋白質(zhì) （圖3中泳道2），可以用于進(jìn)一步的酶學(xué)性質(zhì)研究，純化效率見表1。

2.4 重組MaiA的酶學(xué)性質(zhì)

2.4.1 最適溫度 馬來酸順反異構(gòu)酶重組蛋白在不同的溫度下的相對酶活力見圖4。該酶的最適溫度為37℃，溫度超過45℃和低于35℃時(shí)，相對酶活力急劇下降。

表1 馬來酸順反異構(gòu)酶的純化Table 1 Purification scheme for the recombinant MaiA

圖4 馬來酸順反異構(gòu)酶的最適溫度Fig.4 Optimum temperature of MaiA

2.4.2 最適pH 重組酶在不同的pH條件下的相對酶活力見圖5。該酶在pH 7～9范圍內(nèi)，酶活力保持80%以上；pH值高于9.0或低于7時(shí)酶活力迅速降低，表明最適pH值為8.4。

圖5 馬來酸順反異構(gòu)酶的最適pH值Fig.5 Optimum pH of MaiA

2.4.3 馬來酸順反異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性 重組酶分別在55℃和60℃放置不同時(shí)間后其殘留酶活見圖6。在55℃時(shí)，馬來酸順反異構(gòu)酶的半衰期約為1.5 h；而在60℃，半衰期約為30 min。

2.4.4 底物對馬來酸順反異構(gòu)酶催化效率的影響重組酶的反應(yīng)初速度變化見圖7。當(dāng)初始底物低于50 mmol/L時(shí)，反應(yīng)的初速度成線性增長；高于500 mmol/L時(shí)，反應(yīng)速度趨于最大；高于2 000 mmol/L時(shí)，反應(yīng)初速度開始下降，說明過高的底物濃度可能對反應(yīng)速度產(chǎn)生了抑制作用。

圖6 馬來酸順反異構(gòu)酶的熱穩(wěn)定性Fig.6 Thermostability of MaiA

圖7 初始底物濃度對馬來酸順反異構(gòu)酶催化初速度的影響Fig.7 Effect of substrate concentration on MaiA

在測定底物濃度對MI催化效率影響的同時(shí)，作者發(fā)現(xiàn)，反應(yīng)體系中的底物馬來酸幾乎可以完全轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物富馬酸，轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%以上。盡管底物濃度達(dá)到2 000 mmol/L以上時(shí)反應(yīng)速度會(huì)降低，馬來酸完全轉(zhuǎn)化為富馬酸的時(shí)間會(huì)延長，但是依然不影響酶的轉(zhuǎn)化效率，見圖8。當(dāng)?shù)孜餄舛葹?00 mmol/L和1 000 mmol/L時(shí)，完全轉(zhuǎn)化時(shí)間約為3 h和6 h，當(dāng)?shù)孜餄舛壬咧? 000 mmol/L時(shí)，需將近21 h將底物完全轉(zhuǎn)化。

圖8 底物濃度對轉(zhuǎn)化時(shí)間的影響Fig.8 Effect of substrate concentration on conversion time

2.4.5 馬來酸順反異構(gòu)酶的酶學(xué)常數(shù) 在最適條件下測定馬來酸順反異構(gòu)酶的最大反應(yīng)速度Vmax和米氏常數(shù)Km，采用雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver Burk法）作圖，見圖9。根據(jù)米氏方程求出馬來酸順反異構(gòu)酶的Km為4.20 mmol/L，最大反應(yīng)速度Vmax為1.27 mmol/（L·min），進(jìn)一步計(jì)算得到轉(zhuǎn)化數(shù)kcat為 4.38 s-1，酶的催化效率 kcat/Km為 1.04 L/（mmol·s）。

圖9 馬來酸順反異構(gòu)酶的Lineweaver Burk圖Fig.9 Lineweaver Burk’s plot of MaiA

3 結(jié)語

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)了數(shù)種能將馬來酸轉(zhuǎn)化為富馬酸的菌株，但是大部分菌株存在酶催化活力低、穩(wěn)定性差等問題，無法應(yīng)用于工業(yè)化生產(chǎn)富馬酸[7，9，12]。 S.marcescens 來源的馬來酸順反異構(gòu)酶在室溫有較好的穩(wěn)定性，酶比活力也相對其他菌株來源的要高[7]。2000年，日本三菱化工股份有限公司擴(kuò)增表達(dá)了S.marcescens來源的馬來酸順反異構(gòu)酶基因，并測得了該酶的相對分子質(zhì)量為28 000[8]。然而，其相關(guān)酶學(xué)性質(zhì)尚未見報(bào)道，而這些數(shù)據(jù)對于該酶的工業(yè)應(yīng)用有著至關(guān)重要的意義。

在E.coli中表達(dá)、純化得到S.marcescens來源的馬來酸順反異構(gòu)的重組酶，其比活力為48.01 U/mg，比W.Scher[12]等人報(bào)道P.puorescens來源的馬來酸異構(gòu)酶的比活力（24.1 U/mg）高了一倍，顯示了其作為工業(yè)用酶的優(yōu)越性。作者首次系統(tǒng)地報(bào)道了該酶的酶學(xué)性質(zhì)，表明重組酶最適pH為8.4，與W.Scher[12]報(bào)道的 P.puorescens MaiA （最適 pH是 8.4）和K.Hatakeyama[7]等人報(bào)道的 A.faecalis MaiA（最適pH是8.0）的最適pH相似相似。同時(shí)發(fā)現(xiàn)與A.faecalis[7]（在50℃時(shí)的半衰期只有30 min）相比，S.marcescens來源的重組馬來酸順反異構(gòu)酶（在55℃下半衰期約為1.5 h）具有更好的熱穩(wěn)定性。值得一提的是，本研究發(fā)現(xiàn)馬來酸順反異構(gòu)酶催化馬來酸生成富馬酸的轉(zhuǎn)化率可達(dá)99%以上，這項(xiàng)性質(zhì)有利于獲得高純度的富馬酸產(chǎn)物，顯示了該酶在應(yīng)用于催化富馬酸合成應(yīng)用中具有優(yōu)越的潛能。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果為馬來酸順反異構(gòu)酶的理論研究及酶法制備馬來酸的工業(yè)應(yīng)用提供了理論支持。

同時(shí)，本研究改進(jìn)了馬來酸與富馬酸的分離方法[7，11-12]，采用高效液相色譜法（HPLC）使底物馬來酸與產(chǎn)物富馬酸完全分離，并可測得其濃度，提高了馬來酸順反異構(gòu)酶活力測定的精確性。

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