基于支持向量機(jī)和模糊推理的畢赤酵母發(fā)酵過程故障診斷

高敏杰 ， 丁 健 ， 張 許 ， 高 鵬

（1．江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2．江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫214122）

甲醇營養(yǎng)型畢赤酵母 （Methylotrophic Pichia pastoris）是一種優(yōu)良的外源蛋白表達(dá)系統(tǒng)，近年來應(yīng)用十分廣泛。此表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)勢是它具有強(qiáng)有力的醇氧化酶（AOX1）啟動(dòng)子，可嚴(yán)格調(diào)控外源蛋白的表達(dá)，但也存在不足之處：一是培養(yǎng)周期相對大腸桿菌較長，二是誘導(dǎo)期對甲醇濃度比較敏感。在誘導(dǎo)階段，甲醇同時(shí)作為碳源、能源和誘導(dǎo)劑，直接影響到細(xì)胞生長、氧氣消耗、產(chǎn)物生成和外源蛋白的水解[1-5]。將甲醇濃度控制在適宜水平，是目的蛋白高效表達(dá)的前提條件。采用氣相色譜離線控制甲醇濃度時(shí)，雖然檢測結(jié)果比較準(zhǔn)確，但存在檢測步驟繁瑣、檢測時(shí)間長和檢測結(jié)果嚴(yán)重滯后等問題。目前主要采用甲醇電極反饋控制的方法，在線調(diào)節(jié)發(fā)酵罐中甲醇濃度。但甲醇電極容易受環(huán)境條件和其他揮發(fā)性物質(zhì)的影響，測量值與實(shí)際值會(huì)發(fā)生偏差，導(dǎo)致發(fā)酵液中甲醇偏高或偏低，嚴(yán)重影響發(fā)酵過程的穩(wěn)定性[2]。因此，建立一種有效的過程診斷系統(tǒng)，在線監(jiān)測甲醇濃度，并在發(fā)生故障時(shí)采取合適的補(bǔ)救措施，對于提高和穩(wěn)定目的蛋白的產(chǎn)量非常重要。

主成分分析（PCA）是一種基于線性變換的模式識(shí)別和故障診斷方法，應(yīng)用范圍廣泛，但是在處理非線性問題上存在明顯的局限性。將核函數(shù)（Kernel）或自聯(lián)想人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò) （AANN）與標(biāo)準(zhǔn)PCA相結(jié)合，構(gòu)建的改進(jìn)型非線性主成分分析方法（NPCA），在處理非線性故障診斷問題時(shí)，比標(biāo)準(zhǔn)PCA有更好的效果，但仍存在過度訓(xùn)練，無法識(shí)別兩種以上故障狀態(tài)等問題[6-7]。對應(yīng)上述問題，作者提出了一種基于支持向量機(jī)（SVM）和模糊推理的智能型故障診斷系統(tǒng)，用于畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)豬α干擾素（pIFN-α）過程[8]。系統(tǒng)采用SVM的算法構(gòu)建分類器，并將兩個(gè)獨(dú)立的SVM按照二叉樹結(jié)構(gòu)組合，用來識(shí)別發(fā)酵中甲醇濃度的三種狀態(tài)（過量、適中和匱乏）。采用模糊推理的方法確定報(bào)警閾值，可以最終確定發(fā)酵狀態(tài)的類別。隨后針對特定故障類型，采取適當(dāng)?shù)难a(bǔ)救措施，可以使得發(fā)酵過程恢復(fù)正常。

1 材料與方法

1.1 菌株和培養(yǎng)基

巴斯德畢赤酵母Pichia pastoris KM71，MutS菌株：由上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)所重點(diǎn)研究室構(gòu)建，表達(dá)載體和外源基因分別為pPICZαA和IFNα cDNA。包括菌株活化培養(yǎng)基、種子培養(yǎng)基、初始培養(yǎng)基、甘油流加培養(yǎng)基和甲醇流加培養(yǎng)基，培養(yǎng)基組成與前期文獻(xiàn)報(bào)道相同[9]。

1.2 培養(yǎng)方法

發(fā)酵過程在5 L發(fā)酵罐（Biotech-2002，上海保興生物設(shè)備工程有限公司）中進(jìn)行，初始裝液量為1.5 L，接種體積分?jǐn)?shù)為10%，調(diào)節(jié)攪拌轉(zhuǎn)速將DO維持在10%以上，發(fā)酵過程中溫度始終控制在30℃，生長期和誘導(dǎo)期pH分別控制在6.0和5.5。菌體先在發(fā)酵初始培養(yǎng)基上生長10～12 h，當(dāng)甘油耗盡，DO迅速上升時(shí)，采用DO-Stat法流加甘油培養(yǎng)基，使菌體繼續(xù)生長。當(dāng)菌體濃度達(dá)到誘導(dǎo)條件（120～130 g/L左右）后，停止流加甘油，進(jìn)行1～2 h的“饑餓培養(yǎng)”，使酵母細(xì)胞將發(fā)酵液中殘留的甘油和其他可能充當(dāng)替代碳源的中間代謝物質(zhì)全部消耗。之后進(jìn)入誘導(dǎo)期，開始誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)。

1.3 數(shù)據(jù)采集

利用甲醇電極在線測量發(fā)酵液中的甲醇濃度，同時(shí)利用尾氣分析儀測量發(fā)酵尾氣中的O2和CO2分壓并計(jì)算耗氧速率 （OUR）和CO2生成速率（CER）[10]，利用電子天平在線記錄甲醇的質(zhì)量變化，通過計(jì)算單位時(shí)間內(nèi)甲醇的添加量得到甲醇流加速率 （MFR）。所有數(shù)據(jù)通過A/D數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換卡或RS232通信串口傳輸并保存于工控機(jī)中。

1.4 分析方法

1.4.1 細(xì)胞濃度的測定 用單位體積發(fā)酵液的細(xì)胞干重表示，采用比濁法測定[11]。

1.4.2 甲醇濃度的離線測定 采用氣相色譜法[9]。

1.4.3 pIFN-α抗病毒活性的測定 pIFN-α抗病毒活性測定參考中國藥典，詳細(xì)步驟見文獻(xiàn)[11]。本部分實(shí)驗(yàn)在上海農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所進(jìn)行。

1.5 分類器和故障診斷系統(tǒng)的構(gòu)建

1.5.1 分類器的構(gòu)建 支持向量機(jī)（SVM）算法是一種性能良好的分類算法，SVM的學(xué)習(xí)樣本可以表示為（Yi，zi），向量Yi表示第 i組樣本的輸入特征[12]。本文中，Yi是一個(gè)5維向量，包括以下五個(gè)在線過程參數(shù)：發(fā)酵時(shí)間（T）、攪拌轉(zhuǎn)速（AT）、甲醇流加速率 （MFR）、CER 和 OUR，即 Yi=[T，AT，MFR，CER，OUR]i。這5個(gè)參數(shù)綜合體現(xiàn)了隨著發(fā)酵時(shí)間的進(jìn)行細(xì)胞在誘導(dǎo)期的生理狀態(tài)變化（甲醇匱乏、適中或者過量），但它們之間的關(guān)系非常復(fù)雜，需要建立智能模型進(jìn)行識(shí)別。zi表示Yi對應(yīng)的特征標(biāo)簽，取值為“+1”、“0”或“-1”，表示 Yi的類別，見圖 1。

圖1 SVM分類Fig.1 SVM classification

如圖1所示，超平面H1將樣本點(diǎn)分為兩類，H1由WX+b=0表示，H2和H3是一對平行的超平面，分別被定義為WX+b=1和WX+b=-1。SVM算法的目的是在保證二者均能對樣本點(diǎn)進(jìn)行正確分類的前提下，最大化它們之間的距離2/‖W‖，即最小化1/2‖W‖2，從而求解出分類超平面H1。若分類正確，則所有的樣本 Xi（i=1，2，……，N）均應(yīng)滿足 yi×（WXi+b）≥1，H1的求解過程可以用下述參數(shù)優(yōu)化問題表示：

引入松弛變量ξi、懲罰因子C和拉格朗日乘子αi、βi，然后分別對 W、b、αi和 βi并求偏導(dǎo)，并將偏導(dǎo)置零，原問題可轉(zhuǎn)化為：

對未知X分類的判別函數(shù)如下：

如果X在原有特征空間內(nèi)不是線性可分的，則可以利用核函數(shù)K（Xi，X），將其映射至更高維的特征空間中再進(jìn)行分類，本文所用的核函數(shù)是最常用的徑向基（Radial basis function，RBF）核函數(shù)。 核函數(shù)和映射后的判別函數(shù)分別如式4—5所示：

標(biāo)準(zhǔn)SVM分類器只能將樣本分為兩類，而本文中的分類問題涉及3種發(fā)酵狀態(tài)的判別。因此，需要構(gòu)建一種由兩個(gè)單一的SVM子分類器組成的二叉樹結(jié)構(gòu)的分類器，用來解決上述多類別分類的問題[8]。 首先將樣本特征 Yi=[T，AT，MFR，CER，OUR]i輸入第一個(gè)子分類器中，可以將樣本分為“正?！迸c“異常”兩類，“正?！庇谩?”表示。 “異常”的樣本進(jìn)入第二個(gè)分類器，進(jìn)一步分為“匱乏”和“過量”兩類，分別用“-1”和“+1”表示。

1.5.2 故障診斷系統(tǒng)的構(gòu)建 通過單一采樣點(diǎn)的樣本特征判斷發(fā)酵過程總體狀態(tài)時(shí)，誤判的可能性很大，因此選取了一段連續(xù)的時(shí)間作為時(shí)間窗口，包含若干個(gè)采樣點(diǎn)。將整個(gè)時(shí)間窗口輸入上述分類器，可以返回等同于采樣點(diǎn)個(gè)數(shù)的標(biāo)簽，但由于存在外部干擾，3個(gè)標(biāo)簽（-1、0和+1）各占一定比例。于是又引入了模糊推理技術(shù)，為報(bào)警界限/閾值的選擇提供理論依據(jù)，解決多個(gè)分類標(biāo)簽判別發(fā)酵狀態(tài)的問題[12]。具體判別過程如下：首先，利用三角型模糊成員函數(shù)將“-1”、“0”和“+1”所占的比例分為“低（Low）”和“高（High）”兩個(gè)水平，再根據(jù)“-1”、“0”和“+1”所占的百分比，計(jì)算出輸入變量模糊成員函數(shù)的隸屬度。將甲醇濃度設(shè)為模糊推理的輸出，取值范圍為-1～+1，并用3個(gè)三角型的模糊成員函數(shù)表示 其 3 個(gè) 水 平 ：“匱 乏 （Shortage，S）”、“適 中（Medium，M）”和“過量（Excess，E）”，然后采用傳統(tǒng)Min-Max法則解模糊化。構(gòu)建如下的模糊規(guī)則：

Rule#1：If label “-1” is High&label “+1” is Low&label“0” is Low，Then biotin is in Shortage（-1）；

Rule#2：If label“-1” is Low&label“+1” is High&label“0”is Low，Then biotin is in Excess（+1）；

Rule#3：If label “-1”is Low&label “+1”is Low&label“0” is High，Then biotin is Medium（0）.

該故障診斷系統(tǒng)的構(gòu)建過程全部使用Matlab軟件編寫程序?qū)崿F(xiàn)，該系統(tǒng)的運(yùn)行流程見圖2。

圖2 基于SVM和模糊推理的故障診斷系統(tǒng)運(yùn)行流程Fig.2 Diagram of the fault diagnosis system incorporating SVM model and fuzzy logic reasoning

2 結(jié)果與分析

2.1 誘導(dǎo)期不同甲醇濃度控制水平下畢赤酵母的發(fā)酵模式

畢赤酵母發(fā)酵過程通常分為3個(gè)階段：甘油分批培養(yǎng)階段、甘油流加階段和甲醇誘導(dǎo)階段，前兩個(gè)階段總稱為細(xì)胞生長期，目的是為了得到高密度的酵母細(xì)胞，甲醇誘導(dǎo)階段向發(fā)酵罐中流加甲醇培養(yǎng)基，誘導(dǎo)外源蛋白表達(dá)[13]。已有文獻(xiàn)報(bào)道表明，甲醇濃度是影響外源蛋白表達(dá)的一個(gè)非常重要的因素。在誘導(dǎo)階段，無論重組畢赤酵母的甲醇利用表型如何，甲醇濃度都需要嚴(yán)格加以控制。濃度過低則誘導(dǎo)強(qiáng)度不夠，目標(biāo)蛋白分泌量少；而濃度過高則會(huì)對細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用，抑制細(xì)胞生長，最終影響外源蛋白表達(dá)[14]。

一般情況下，OUR和生物量（的變化）可以看成是反映細(xì)胞代謝活性的重要狀態(tài)參數(shù)，在改變甲醇濃度控制水平的同時(shí)，對OUR及生物量的變化模式也進(jìn)行了跟蹤監(jiān)測[15]。在甲醇濃度匱乏、適中以及過量的條件下，pIFN-α抗病毒活性和OUR的變化模式見圖3。當(dāng)甲醇質(zhì)量濃度適中時(shí)，細(xì)胞適應(yīng)甲醇誘導(dǎo)環(huán)境后，整個(gè)誘導(dǎo)階段OUR和生物量均相對高而且穩(wěn)定，分別為 250 mmol/（L·h）和 120 g/L，發(fā)酵液中的pIFN-α蛋白活性最高，達(dá)到5.0×106IU/mL。甲醇濃度匱乏的批次中，細(xì)胞代謝活性較低（OUR在 200 mmol/（L·h）左右的低水平徘徊），導(dǎo)致誘導(dǎo)強(qiáng)度嚴(yán)重不足，生物量呈現(xiàn)緩慢下降趨勢，整個(gè)誘導(dǎo)期的pIFN-α抗病毒活性較低，最高抗病毒活性只有1.6×104IU/mL。甲醇濃度過量的條件下，OUR在經(jīng)歷了一個(gè)高峰期（12 h）后便開始逐漸下降、最后在 130 mmol/（L·h）左右的低水平上波動(dòng)，生物量也逐漸降低，最終達(dá)到90 g/L左右。這說明在高甲醇質(zhì)量濃度下，細(xì)胞代謝活性受到較大損壞，pIFN-α抗病毒活性也未能得到提高，最高值停留在8.6×104IU/mL 的水平。

由此可見，在誘導(dǎo)表達(dá)階段，甲醇質(zhì)量濃度對pIFN-α抗病毒活性影響很大，不同甲醇質(zhì)量濃度下細(xì)胞的代謝活性也存在著很大差異。在誘導(dǎo)階段，控制甲醇質(zhì)量濃度于一適中的水平（約10 g/L）是實(shí)現(xiàn)pIFN-α高效表達(dá)的關(guān)鍵。在此甲醇質(zhì)量濃度下，細(xì)胞代謝活性強(qiáng)、OUR高且穩(wěn)定。誘導(dǎo)過程中甲醇質(zhì)量濃度過低（0～5 g/L）或者過高（15～20 g/L）均不利于pIFN-α的表達(dá)，細(xì)胞的代謝活性較弱。

2.2 基于SVM-BTA/FUZZY模型的畢赤酵母發(fā)酵在線故障診斷結(jié)果

將SVM-BTA/FUZZY故障診斷系統(tǒng)用于畢赤酵母發(fā)酵過程的故障診斷。設(shè)定時(shí)間窗口長度為1 h，數(shù)據(jù)采集間隔為1 min，每個(gè)移動(dòng)時(shí)間窗口中含有60組發(fā)酵在線數(shù)據(jù)。每次采集后，都會(huì)將最新的數(shù)據(jù)添加入時(shí)間窗口中，而將其中最早的一組數(shù)據(jù)去除，之后將更新后的移動(dòng)時(shí)間窗口輸入故障診斷系統(tǒng)中判斷當(dāng)前的發(fā)酵狀態(tài)。

圖3 誘導(dǎo)階段不同甲醇質(zhì)量濃度控制水平下的pIFN-α活性、生物量和OUR變化趨勢Fig.3 Changing patterns of pIFN-α antiviral activity，biomass，OUR during induction phase，when setting methanol concentration at different predetermined levels

設(shè)計(jì)了3個(gè)批次誘導(dǎo)階段甲醇質(zhì)量濃度控制水平各不相同的畢赤酵母發(fā)酵實(shí)驗(yàn)用來檢驗(yàn)上述故障診斷系統(tǒng)的性能。批次1中，甲醇質(zhì)量濃度控制在10 g/L左右，處于一適中水平。批次2是故意造成的誘導(dǎo)強(qiáng)度嚴(yán)重不足的批次，甲醇質(zhì)量濃度處于較低的0～5 g/L水平。批次3中，甲醇質(zhì)量濃度較高，平均質(zhì)量濃度超過15～20 g/L，是典型的甲醇“過量”的發(fā)酵批次。這3個(gè)批次中pIFN-α抗病毒活性及生物量變化情況如圖 4（b）、4（d）、4（f）所示，發(fā)酵正常的批次（批次1）pIFN-α抗病毒活性強(qiáng)，生物量高且穩(wěn)定，達(dá)到120 g/L。而發(fā)酵異常的批次無論是pIFN-α抗病毒活性還是生物量的情況均與正常批次有明顯的差異，批次2和批次3的pIFN-α抗病毒活性最終只達(dá)到 8.9×103IU/mL和 2.3×104IU/mL。 如圖 4 （a）、4 （c）、4 （e） 所示，SVM-BTA/FUZZY故障診斷系統(tǒng)能夠快速準(zhǔn)確地識(shí)別出3個(gè)批次畢赤酵母發(fā)酵的狀態(tài)。批次1中，SVM-BTA/FUZZY故障診斷系統(tǒng)的輸出值在整個(gè)誘導(dǎo)期內(nèi)（0～60 h）始終維持在-0.224 4～+0.224 4的范圍內(nèi)，這表示發(fā)酵狀態(tài)的識(shí)別結(jié)果為甲醇濃度“適中”。在批次2中，診斷程序開始運(yùn)行后，SVM-BTA/FUZZY系統(tǒng)的輸出值在1 h內(nèi)迅速上升，并最終穩(wěn)定在+0.673 3的范圍內(nèi)，一直維持到60 h發(fā)酵結(jié)束，表明該批次的診斷結(jié)果為甲醇質(zhì)量濃度 “過量”。在批次3中，發(fā)酵0 h開始運(yùn)行診斷程序后，SVM-BTA/FUZZY系統(tǒng)的輸出結(jié)果很快下降至-0.673 3，并一直維持至60 h發(fā)酵結(jié)束，這表明該批次的診斷結(jié)果為甲醇質(zhì)量濃度 “匱乏”。通過比較SVM-BTA/FUZZY故障診斷系統(tǒng)在上述3個(gè)發(fā)酵批次中的診斷性能，可以得出結(jié)論：由于SVM-BTA/FUZZY系統(tǒng)響應(yīng)速度快，狀態(tài)識(shí)別準(zhǔn)確，魯棒性強(qiáng)，可以作為識(shí)別畢赤酵母發(fā)酵故障的有效工具。以該系統(tǒng)為基礎(chǔ)，可以進(jìn)一步研究畢赤酵母發(fā)酵的故障排除系統(tǒng)。

圖4 利用SVM-BTA/FUZZY故障診斷系統(tǒng)在線識(shí)別診斷畢赤酵母發(fā)酵故障Fig.4 On-line diagnosis results when using SVM-BTA/FUZZY diagnosis system for different fermentations with/without faults

2.3 利用SVM-BTA/FUZZY故障診斷系統(tǒng)挽救“錯(cuò)誤”發(fā)酵，穩(wěn)定發(fā)酵性能

一個(gè)良好的在線發(fā)酵故障診斷和排除系統(tǒng)應(yīng)當(dāng)具備如下特點(diǎn)：1）能夠在發(fā)酵早期檢測出故障；2）在檢測出故障的同時(shí)能夠識(shí)別故障的種類；3）能夠采取適當(dāng)?shù)难a(bǔ)救措施使得發(fā)生故障的發(fā)酵批次恢復(fù)正常。在下面的實(shí)驗(yàn)中，人為設(shè)計(jì)了兩個(gè)具有不同故障的發(fā)酵批次（批次4和批次5），并將上述的SVM-BTA/FUZZY故障診斷系統(tǒng)用于這兩個(gè)批次的在線診斷，根據(jù)診斷結(jié)果及時(shí)采取相應(yīng)的補(bǔ)救措施，以檢驗(yàn)SVM-BTA/FUZZY系統(tǒng)在故障診斷以及故障排除過程中的性能。在批次4中，故意制造甲醇質(zhì)量濃度控制水平“匱乏”的故障，甲醇質(zhì)量濃度處于較低的0～5 g/L水平。在誘導(dǎo)0 h啟動(dòng)故障診斷系統(tǒng)，誘導(dǎo)1 h故障診斷系統(tǒng)的輸出值收斂于-0.673 3，即輸出的類別標(biāo)簽為“S”。 發(fā)酵3 h，故障診斷系統(tǒng)已經(jīng)連續(xù)輸出類別標(biāo)簽“S”超過1 h，有理由相信發(fā)酵確實(shí)處于甲醇質(zhì)量濃度“匱乏”的狀態(tài)，因此向發(fā)酵液中添加適量的甲醇以提高甲醇質(zhì)量濃度。如圖5（a）所示，在加入甲醇之后，故障診斷系統(tǒng)的輸出值開始迅速上升并最終穩(wěn)定于0.000 0，輸出的類別標(biāo)簽也轉(zhuǎn)變?yōu)椤癕”，這一診斷結(jié)果一直持續(xù)至發(fā)酵結(jié)束。如圖5（c）所示，在加入甲醇后，pIFN-α抗病毒活性明顯提高，最高達(dá)到2.0×106IU/mL的正常水平。

在批次5中，故意制造甲醇質(zhì)量濃度“過量”的故障，平均質(zhì)量濃度為15～20 g/L。仍然在誘導(dǎo)0 h啟動(dòng)故障診斷程序，發(fā)酵故障在6 h被診斷出。直至誘導(dǎo)7 h，SVM-BTA/FUZZY系統(tǒng)的輸出值穩(wěn)定于+0.673 3的水平超過1 h，可以確認(rèn)發(fā)酵狀態(tài)確實(shí)被診斷為甲醇質(zhì)量濃度“過量”。因此，在這一時(shí)刻采取相應(yīng)的補(bǔ)救措施，暫停流加甲醇，同時(shí)為了增強(qiáng)細(xì)胞活性，開始以 2 g/（L·h）速度添加甘油，使得發(fā)酵恢復(fù)正常的有效補(bǔ)救措施。如圖5（b）所示，在暫停流加甲醇之后，SVM-BTA/FUZZY系統(tǒng)的輸出值快速下降，重新回到并穩(wěn)定在0.00 00，發(fā)酵狀態(tài)的識(shí)別結(jié)果轉(zhuǎn)變?yōu)榧状假|(zhì)量濃度“適量”，并持續(xù)至誘導(dǎo)結(jié)束。該批次pIFN-α抗病毒活性變化情況見圖5（d）。在停止流加甲醇之后，pIFN-α抗病毒活性逐漸升高，最高達(dá)到3.2×106IU/mL的較高水平。這說明如果能及時(shí)采取補(bǔ)救措施，原本可能失敗的發(fā)酵批次仍然可以恢復(fù)正常。從這兩個(gè)批次的驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)中可以看出，SVM-BTA/FUZZY發(fā)酵故障診斷/排除系統(tǒng)能夠及時(shí)發(fā)現(xiàn)甲醇質(zhì)量濃度不適宜的故障，并采取有效的補(bǔ)救措施使得發(fā)酵過程恢復(fù)正常，提高了畢赤酵母發(fā)酵生產(chǎn)的穩(wěn)定性。

圖5 發(fā)酵故障的在線診斷及排除Fig.5 On-line fermentation faults diagnosis and rescue

圖3所示的甲醇質(zhì)量濃度“適中”、“匱乏”以及“過量”的狀態(tài)下的發(fā)酵過程參數(shù)具有明顯的差異，甚至僅僅通過觀察OUR的大小就可以判斷發(fā)酵狀態(tài)，但利用智能型故障診斷系統(tǒng)識(shí)別并排除發(fā)酵故障仍是十分有必要的。原因如下：1）圖3中所包含的發(fā)酵異常條件下的數(shù)據(jù)均是在故障極其嚴(yán)重的極端條件下采集得到的，這才會(huì)導(dǎo)致各發(fā)酵狀態(tài)下過程參數(shù)的差異如此明顯。在實(shí)際的發(fā)酵生產(chǎn)中，大多數(shù)異常批次的過程參數(shù)所表現(xiàn)出的特點(diǎn)并沒有圖3中所示的那樣明顯，而是處于一個(gè)中間狀態(tài)，通過簡單的觀察很難發(fā)現(xiàn)其中的規(guī)律。2）在誘導(dǎo)初期，故障批次和正常批次過程參數(shù)的差異不大，即便是發(fā)生了極其嚴(yán)重的故障，也很難通過直接觀察來判斷。當(dāng)操作人員通過觀察發(fā)現(xiàn)故障時(shí)，說明故障的現(xiàn)象已經(jīng)很明顯，已錯(cuò)過了采取補(bǔ)救措施的最佳時(shí)機(jī)。3）由于發(fā)酵過程參數(shù)對外部操作（例如添加消泡劑、酸、堿等）的干擾十分敏感，因此僅依靠某個(gè)單獨(dú)的過程參數(shù)的高低來判斷發(fā)酵狀態(tài)是不可靠的。4）某一個(gè)參數(shù)或多個(gè)參數(shù)的大小關(guān)系很容易確定，但是要獲得這些參數(shù)變化模式的信息，僅僅依靠簡單的觀察很難實(shí)現(xiàn)。綜上所述，本研究中所提出的SVM-BTA/FUZZY智能型故障診斷系統(tǒng)能夠增強(qiáng)故障判斷的準(zhǔn)確性和魯棒性，對于那些故障信息以及菌體生理狀態(tài)不是很明顯的中間狀態(tài)的識(shí)別十分有效。

2.4 不同甲醇質(zhì)量濃度控制水平對代謝途徑關(guān)鍵酶AOX的影響

醇氧化酶 （AOX）是催化甲醇代謝和外源蛋白合成表達(dá)的第一個(gè)關(guān)鍵酶，其活性高低直接影響甲醇的消耗速率、細(xì)胞代謝活性以及外源蛋白（pIFN-α）抗病毒活性[16]。甲醇質(zhì)量濃度是影響AOX活性和發(fā)酵生產(chǎn)性能的重要操作參數(shù)。研究表明，合適的甲醇質(zhì)量濃度水平是實(shí)現(xiàn)pIFN-α高效表達(dá)的前提。分別控制甲醇質(zhì)量濃度在“適中”、“過量”以及“匱乏”的條件下，所得關(guān)鍵酶AOX的活性變化見圖6。結(jié)果表明，誘導(dǎo)期甲醇質(zhì)量濃度的控制水平高低會(huì)對AOX酶的活性造成顯著的影響。在發(fā)酵過程中，甲醇質(zhì)量濃度“適中”條件下的AOX酶活性明顯高于另外兩個(gè)條件，在40 h時(shí)達(dá)到最高為16.3 U/g。甲醇濃度“匱乏”和“過量”條件下AOX酶活性都很低，即使達(dá)到的最高值也處于甲醇質(zhì)量濃度“適中”時(shí)的最低水平。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，由于甲醇質(zhì)量濃度控制水平不當(dāng)，細(xì)胞遭遇到長時(shí)間的高質(zhì)量濃度或低質(zhì)量濃度的甲醇環(huán)境，使得AOX酶的活性受到強(qiáng)烈的抑制，AOX無法正常啟動(dòng)。甲醇質(zhì)量濃度“匱乏”和“過量”條件下，pIFN-α無法正常表達(dá)、發(fā)酵性能不穩(wěn)定的根本原因就在于此。

圖6 不同甲醇質(zhì)量濃度控制水平對AOX活性的影響Fig.6 Effects of methanol concentrations at different predetermined levels on the activities

3 結(jié)語

構(gòu)建基于SVM和模糊推理的智能型故障診斷系統(tǒng)，用于識(shí)別畢赤酵母發(fā)酵誘導(dǎo)期甲醇質(zhì)量濃度“匱乏”、“適中”和“過量”3種發(fā)酵狀態(tài)模式。該系統(tǒng)可以在誘導(dǎo)初期準(zhǔn)確識(shí)別故障的發(fā)生和類型，根據(jù)診斷結(jié)果對故障批次采取補(bǔ)加甲醇或停止流加甲醇、補(bǔ)加甘油的補(bǔ)救措施。通過有效的補(bǔ)救，上述故障診斷系統(tǒng)的識(shí)別結(jié)果逐漸返回到甲醇質(zhì)量濃度“適中”的范圍內(nèi)，所有發(fā)酵批次的pIFN-α抗病毒活性均達(dá)到2.0～5.0×106IU/mL的正常水平，發(fā)酵穩(wěn)定性顯著提高。

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