原料碳氮比對丁醇發(fā)酵兩階段發(fā)酵性能的影響

李 鑫 ， 李志剛 ， 史仲平 *

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫，214122；2.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫214122）

丁醇，既是重要的化工原料，又是一種新型液體生物燃料。相比傳統(tǒng)液態(tài)生物燃料—乙醇，丁醇在化學(xué)結(jié)構(gòu)上多兩個亞甲基，因此具有更高的疏水性，較低的揮發(fā)性，可與汽油以任意比例混合，并具有與汽油相當(dāng)?shù)臒嶂礫1]。丁醇的生物發(fā)酵一般利用產(chǎn)溶劑梭菌Clostridia在嚴(yán)格厭氧條件下進(jìn)行的，其主要產(chǎn)物為丁醇、丙酮和乙醇，比例約為6∶3∶1。目前，厭氧發(fā)酵生產(chǎn)生物丁醇的主要原料為玉米等糧食資源。近年來，由于受到人口增長、耕地減少、以及生物煉制行業(yè)迅速發(fā)展等因素的影響，糧食類原料的價格節(jié)節(jié)攀升，以致丁醇發(fā)酵的生產(chǎn)成本大幅提高。研究者們嘗試了多種非糧作物或農(nóng)業(yè)廢棄物為原料進(jìn)行丁醇發(fā)酵，包括木薯[2-3]、玉米秸稈[4-5]、大麥稈[6]等。但這類原料在營養(yǎng)成分上存在共同的缺陷，含碳量高而含氮量極低，營養(yǎng)比例嚴(yán)重失衡。Madihah等在碳源總量（50 g/L西米椰子淀粉）固定的情況下，以酵母浸粉和NH4NO3為混合氮源并設(shè)置不同濃度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著發(fā)酵原料的碳氮比由3.6 mol/mol逐步提高到42.8 mol/mol時，總?cè)軇┊a(chǎn)量由26.98 g/L直線下降至2.63 g/L[7]。由此可見，原料的碳氮比是影響丁醇發(fā)酵溶劑產(chǎn)量的一個極為主要的因素。以往的研究主要集中在優(yōu)化發(fā)酵初始的原料碳氮配比，而忽略了丁醇發(fā)酵存在產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期兩個階段。作者以葡萄糖和酵母浸粉為碳氮源配制合成培養(yǎng)基，在發(fā)酵產(chǎn)酸和產(chǎn)溶劑兩個階段分別設(shè)置不同碳氮比，比較丙丁梭菌在相應(yīng)階段、不同碳氮比培養(yǎng)條件下產(chǎn)氣、耗糖、產(chǎn)酸、相轉(zhuǎn)型和產(chǎn)溶劑等方面的性能。然后采用玉米粉、木薯粉和豆餅粉三種碳氮比含量差別明顯的原料，進(jìn)行丙酮丁醇發(fā)酵，進(jìn)一步闡明了原料碳氮比對發(fā)酵過程產(chǎn)酸、相轉(zhuǎn)型和溶劑中丁醇比例的影響。

1 材料與方法

1.1 菌株

作者所在實驗室保藏的丙酮丁醇梭狀芽孢桿菌（Clostridium acetobutylicum ATCC824），于質(zhì)量濃度5 g/dL的玉米培養(yǎng)基中培養(yǎng)成孢子液，4℃冰箱保存。

1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：玉米粉經(jīng)40目篩子過篩。使用5 g/dL的玉米粉，加蒸餾水煮沸糊化60 min，pH自然，121℃滅菌50 min。

葡萄糖培養(yǎng)基Ⅰ：葡萄糖質(zhì)量濃度固定為100 g/L，酵母浸粉質(zhì)量濃度分別為 0、1.25、5、10、20 g/L，其它成分包括 KH2PO40.5 g/L、FeSO4·7H2O 0.01 g/L，pH 6.0，121℃滅菌 20 min。

葡萄糖培養(yǎng)基Ⅱ：葡萄糖質(zhì)量濃度固定為50 g/L，酵母浸粉質(zhì)量濃度分別為 0、1.25、2.5、5 g/L，其它成分包括與葡萄糖培養(yǎng)基Ⅰ相同，pH 4.5，121℃滅菌20 min。

玉米培養(yǎng)基：玉米粉經(jīng)40目篩子過篩。傳統(tǒng)發(fā)酵發(fā)酵使用15 g/dL的玉米粉，蒸餾水配料，順序添加液化酶（8 U/g淀粉，沸水浴中液化45 min），糖化酶（130 U/g淀粉，62℃下糖化 60 min）制備，pH 自然，121℃滅菌20 min。

木薯培養(yǎng)基：木薯粉經(jīng)40目篩子過篩。傳統(tǒng)發(fā)酵使用15 g/dL的木薯粉，制備方法同玉米粉。

豆餅粉培養(yǎng)基：豆餅粉經(jīng)40目篩子過篩。傳統(tǒng)發(fā)酵使用7.5 g/dL的豆餅粉，制備方法同玉米粉。由于豆餅粉碳源質(zhì)量濃度嚴(yán)重不足，制備完成后需補(bǔ)加已滅菌的葡萄糖溶液至還原糖質(zhì)量濃度為70 g/L，pH 6.0。

1.3 實驗方法

1.3.1 種子液的制備 將保存的孢子液按體積分?jǐn)?shù)10%接入裝有50 mL種子培養(yǎng)基的厭氧瓶中，抽真空2 min，再先后經(jīng)過沸水熱處理1 min，冰水冷處理1 min，最后置于37℃恒溫水浴，培養(yǎng)26 h后作為發(fā)酵菌種。

1.3.2 不同碳氮比對丁醇發(fā)酵產(chǎn)酸期影響的實驗將制備好的種子液按體積分?jǐn)?shù)10%分別接入無氮或碳氮比為 373.5、93.4、46.7、23.3 mol/mol的葡萄糖培養(yǎng)基Ⅰ中，置于37℃恒溫水浴培養(yǎng)，以菌體產(chǎn)氣停止作為發(fā)酵終止的條件。每組相同的碳氮比均設(shè)有3個平行對照。

1.3.3 不同碳氮比對丁醇發(fā)酵產(chǎn)溶劑期影響的實驗 將制備好的種子液按體積分?jǐn)?shù)10%接入含10 g/L酵母浸粉（碳氮比46.7 mol/mol）的葡萄糖培養(yǎng)基Ⅰ中，置于37℃恒溫水浴培養(yǎng)。菌體發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)溶劑期后（24 h），逐瓶離心收集菌體，并將菌體分別接入無氮或碳氮比為 373.5、93.4、46.7、23.3 mol/mol的葡萄糖培養(yǎng)基Ⅱ中，并保證與離心前的培養(yǎng)基菌體濃度相同，37℃恒溫水浴繼續(xù)培養(yǎng)至菌體產(chǎn)氣停止。每組相同的碳氮比均設(shè)有3個平行對照。

1.3.4 發(fā)酵方法 玉米粉、木薯粉和豆餅粉發(fā)酵方法相同。采用7 L厭氧發(fā)酵罐（由上海保興生物設(shè)備工程有限公司按設(shè)計要求專門訂做），裝液量2.5 L，配有螺旋蛇管，連接恒溫循環(huán)水浴槽可在靜態(tài)條件下將發(fā)酵溫度控制在37℃。為保證罐內(nèi)厭氧環(huán)境，接種前向裝有培養(yǎng)基的罐中持續(xù)通氮氣15 min，并調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH于6.0。按體積分?jǐn)?shù)10%接入種子液，輕微攪拌后關(guān)閉攪拌。如需添加酵母浸粉（添加量2.5 g/L），則將制備好的酵母浸粉濃縮液于115℃滅菌20 min，由蠕動泵打入。

1.4 分析方法

1.4.1 發(fā)酵有機(jī)酸和溶劑的測定 氣相色譜測定[8]。

1.4.2 發(fā)酵產(chǎn)氣的測定 量筒排水置換法[8]。

1.4.3 淀粉和葡萄糖的測定 淀粉以酸水解發(fā)測定，所測還原糖（葡萄糖）質(zhì)量濃度與淀粉質(zhì)量濃度的換算方式為：淀粉質(zhì)量濃度=還原糖質(zhì)量濃度×0.9[8]；葡萄糖利用生物傳感器（SBA-40B，山東科學(xué)院）測定[8]。

1.4.4 原料總蛋白質(zhì)量濃度測定 原料以固態(tài)形式酸水解后測定總氨基酸含量[9]。

1.4.5 碳氮比的計算 原料中的碳含量，均以初始測定的還原糖（葡萄糖）質(zhì)量濃度CGlu計算；原料中的氮含量按其總蛋白質(zhì)量濃度Cprotein的16%計算，碳氮比計算見下式：

2 結(jié)果與討論

2.1 不同碳氮比培養(yǎng)條件對丙丁梭菌產(chǎn)酸和發(fā)酵相轉(zhuǎn)型的影響

丁醇發(fā)酵初期，大量的有機(jī)酸如乙酸、丁酸等被合成，導(dǎo)致發(fā)酵液pH值迅速下降，這一時期稱之為發(fā)酵產(chǎn)酸期。在此階段，菌體快速生長，并伴隨著大量氣體（主要是CO2和H2）的產(chǎn)生，因此，可以通過測定發(fā)酵產(chǎn)氣來判斷菌體的生長狀況。當(dāng)有機(jī)酸的積累達(dá)到一定量的時候，丙丁梭菌產(chǎn)酸能力逐漸減弱，轉(zhuǎn)而吸收發(fā)酵液中積累的有機(jī)酸合成丙酮、丁醇和乙醇等溶劑，這一過程稱之為相轉(zhuǎn)型。發(fā)酵過程順利完成相轉(zhuǎn)型是合成溶劑的先決條件。我們在發(fā)酵初始設(shè)置5個梯度的碳氮比，包括無氮、373.5、93.4、46.7、23.3 mol/mol。 圖 1 是不同碳氮比培養(yǎng)條件下丙丁梭菌發(fā)酵性能的比較。

圖1 不同碳氮比培養(yǎng)條件下丙丁梭菌產(chǎn)酸期發(fā)酵性能的比較Fig.1 Performance comparisons of the acidogeneic state Clostridium acetobutylicum cultured in the media with different carbon/nitrogen ratios

如圖1所示，隨著培養(yǎng)基中氮源質(zhì)量濃度的升高，即碳氮比降低，丙丁梭菌在發(fā)酵前期產(chǎn)氣速率加快，葡萄糖的消耗量也增大，說明高氮源添加量能夠明顯刺激菌體生長。同時，發(fā)酵液中有機(jī)酸的累積量也隨之提高。丙丁梭菌的生長速度與有機(jī)酸產(chǎn)量是相偶聯(lián)的，菌體生長需要大量能量物質(zhì)ATP的參與，而乙酸和丁酸的合成是胞內(nèi)除糖酵解途徑外的主要ATP生成途徑。但菌體生長過快時，發(fā)酵液中會迅速積累大量有機(jī)酸，導(dǎo)致菌體細(xì)胞中毒，而發(fā)酵在糖并未完全耗完、且溶劑產(chǎn)量還極低的情況下提前中止，這一現(xiàn)象稱為“酸崩潰”[10]。在碳氮比為23.3 mol/mol時，觀察到此現(xiàn)象：發(fā)酵9 h時乙酸和丁酸總量已經(jīng)達(dá)到3.5 g/L，之后一直處于4 g/L的高質(zhì)量濃度水平，發(fā)酵過程遲遲無法轉(zhuǎn)入產(chǎn)溶劑期，產(chǎn)氣速率在16 h后出現(xiàn)急劇下降，最終發(fā)酵在40 h中止，溶劑總產(chǎn)量僅有3.98 g/L。另一方面，當(dāng)碳氮比過高（373.5 mol/mol）時，菌體發(fā)酵前期產(chǎn)氣明顯不足，糖消耗緩慢，與生長偶聯(lián)的有機(jī)酸產(chǎn)量也明顯偏低，這些均反映出菌體生長活力不強(qiáng)。進(jìn)入轉(zhuǎn)型期時，僅有的氮源可能已消耗殆盡，發(fā)酵無法繼續(xù)進(jìn)行。相比較下，適中的碳氮比（46.7～93.4 mol/mol）能夠保證菌體在發(fā)酵前期生長速度正常，不至于過分刺激或是抑制有機(jī)酸的合成。發(fā)酵16 h后順利轉(zhuǎn)入產(chǎn)溶劑期，發(fā)酵液中有機(jī)酸濃度迅速回落，溶劑產(chǎn)量逐漸增加。另外，當(dāng)葡萄糖培養(yǎng)基中完全不含氮源時，幾乎測量不到有氣體產(chǎn)生，也沒有有機(jī)酸或溶劑的積累，表明菌體在此條件下無法正常代謝。

2.2 不同碳氮比培養(yǎng)條件對丙丁梭菌溶劑總產(chǎn)量及其中丁醇比例的影響

丁醇發(fā)酵產(chǎn)溶劑期是丙丁梭菌生長的穩(wěn)定期，這一時期菌體可能對碳、氮源的需求量與產(chǎn)酸期（菌體的對數(shù)生長期）有所不同。但產(chǎn)溶劑期是菌體經(jīng)歷產(chǎn)酸期后的下一階段，發(fā)酵過程不能跳過產(chǎn)酸期直接進(jìn)入產(chǎn)溶劑期。如果與前面實驗方法一樣，從初始就設(shè)置不同碳氮比的培養(yǎng)條件，可能會出現(xiàn)產(chǎn)溶劑期適用的碳氮比不適合產(chǎn)酸期，導(dǎo)致無法順利通過相轉(zhuǎn)型。因此，為了保證菌體能順利進(jìn)入產(chǎn)溶劑期，利用合適碳氮比（46.7 mol/mol）的葡萄糖培養(yǎng)基Ⅰ對丙丁梭菌進(jìn)行培養(yǎng)。當(dāng)發(fā)酵進(jìn)入產(chǎn)溶劑期后（24 h），分瓶將菌體離心收集，再轉(zhuǎn)入等體積、含不同碳氮比的葡萄糖培養(yǎng)基Ⅱ中，培養(yǎng)基pH在菌體轉(zhuǎn)入前一律調(diào)節(jié)到更適合溶劑合成的值4.5。葡萄糖培養(yǎng)基Ⅱ中設(shè)有4個梯度的碳氮比，包括無氮、186.7、93.4、46.7 mol/mol。圖2為進(jìn)入產(chǎn)溶劑期的丙丁梭菌在轉(zhuǎn)入不同碳氮比培養(yǎng)基后發(fā)酵性能的比較。

如圖2所示，進(jìn)入產(chǎn)溶劑期的丙丁梭菌經(jīng)過轉(zhuǎn)接后，并沒有重新進(jìn)入產(chǎn)酸期合成大量有機(jī)酸，不同碳氮比實驗組的發(fā)酵液中有機(jī)酸積累量均穩(wěn)定在1～1.5 g/L。發(fā)酵10 h后各實驗組均檢測到不同程度的溶劑產(chǎn)量，對比種子液接種的發(fā)酵10 h后幾乎檢測不到溶劑產(chǎn)生，表明經(jīng)過轉(zhuǎn)接的菌體仍然處于產(chǎn)溶劑期。但菌體生產(chǎn)溶劑的水平，在轉(zhuǎn)接后普遍偏低。含氮量最高、碳氮比最低（46.7 mol/mol）的實驗組，在葡萄糖的消耗速率和菌體產(chǎn)氣速率方面是最快的；同時，丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量也是4個實驗組中最高的，分別為8.75、15.27 g/L。但其丁醇產(chǎn)量并未達(dá)到產(chǎn)物抑制濃度（12～14 g/L丁醇），且相比之前從產(chǎn)酸期就在碳氮比46.7 mol/mol的葡萄糖培養(yǎng)基Ⅰ中發(fā)酵的水平 （丁醇和總?cè)軇┊a(chǎn)量分別為13.77、22.04 g/L），有明顯差距。另外，值得注意的是，進(jìn)入產(chǎn)溶劑期的丙丁梭菌轉(zhuǎn)接到完全無氮的培養(yǎng)條件下，可以監(jiān)測到氣體產(chǎn)生和葡萄糖的消耗，也檢測到有機(jī)酸和溶劑的生成，表明進(jìn)入產(chǎn)溶劑期的丙丁梭菌可以無氮培養(yǎng)條件下存活并合成溶劑。

圖2 進(jìn)入產(chǎn)溶劑期的丙丁梭菌在不同碳氮比培養(yǎng)條件下發(fā)酵性能的比較Fig.2 Performance comparisons of the solventogenic state Clostridium acetobutylicum in the media with different carbon/nitrogen ratios

對于丙丁梭菌在轉(zhuǎn)接后合成溶劑的水平下降，分析原因可能是轉(zhuǎn)接前培養(yǎng)基中積累有一定量的有機(jī)酸，而轉(zhuǎn)接以后的培養(yǎng)集中不含有機(jī)酸。丙丁梭菌在產(chǎn)溶劑期不僅消耗葡萄糖，還會吸收培養(yǎng)基中產(chǎn)酸期積累的乙酸和丁酸用于生產(chǎn)丁醇、丙酮和乙醇等溶劑。因此，嘗試在轉(zhuǎn)接菌體之前，向葡萄糖培養(yǎng)基Ⅱ中添加終質(zhì)量濃度為4 g/L的有機(jī)酸 （乙酸、丁酸各2 g/L），仍調(diào)節(jié)培養(yǎng)基初始pH為4.5。如圖3所示，相比未加入有機(jī)酸的實驗組，添加一定濃度有機(jī)酸后，各碳氮比實驗組的丙丁梭菌產(chǎn)氣速率略有提高，而葡萄糖消耗量則有明顯提高，說明產(chǎn)溶劑期初期發(fā)酵液中積累的有機(jī)酸不僅可以作為合成溶劑的底物，也能刺激菌體對葡萄糖的代謝。不同碳氮比實驗組中，仍是含氮量越高的菌體產(chǎn)氣速率和葡萄糖消耗速率越快，但并不是溶劑產(chǎn)量越高。如圖3d所示，無氮條件下丙丁梭菌生產(chǎn)總?cè)軇?6.42 g/L，當(dāng)培養(yǎng)基中氮源質(zhì)量濃度增加時，溶劑產(chǎn)量也隨之提高，在碳氮比為93.4 mol/mol時，總?cè)軇┊a(chǎn)量達(dá)到20.97 g/L。繼續(xù)增加含氮量使碳氮比降低至46.7 mol/mol時，總?cè)軇┊a(chǎn)量沒有提高反而略微降低，達(dá)到19.99 g/L。進(jìn)一步分析合成的溶劑中丁醇、丙酮的分配比例，如圖4所示，發(fā)現(xiàn)雖然無氮條件下總?cè)軇┊a(chǎn)量最低，但丁醇產(chǎn)量并不低，達(dá)到11.48 g/L，占總?cè)軇┊a(chǎn)量的69.9%，與主要副產(chǎn)物丙酮的質(zhì)量比為3.3∶1。當(dāng)培養(yǎng)條件為中、高碳氮比（186.7、93.4 mol/mol）時，丁醇產(chǎn)量有所增強(qiáng)，分別達(dá)到12.34、13.95 g/L。但副產(chǎn)物丙酮和乙醇的產(chǎn)量也隨之提高，丁醇占總?cè)軇┲斜壤S持在67.0%左右，丁醇/丙酮質(zhì)量比下降至3.0∶1。繼續(xù)增加氮源在培養(yǎng)基中的比例至碳氮比為46.7 mol/mol時，丁醇產(chǎn)量不再提高，穩(wěn)定在12.81 g/L，而副產(chǎn)物丙酮和乙醇的產(chǎn)量則繼續(xù)增加，丁醇對總?cè)軇┖捅谋壤謩e下降至64.1%和2.7∶1。實驗結(jié)果表明，高碳低氮、甚至無氮的培養(yǎng)環(huán)境并不影響丙丁梭菌在產(chǎn)溶劑期生產(chǎn)丁醇，反而更有利于抑制副產(chǎn)物丙酮和乙醇等的合成，提高總?cè)軇┲心繕?biāo)產(chǎn)物丁醇的比例。

圖3 進(jìn)入產(chǎn)溶劑期的丙丁梭菌在添加相同有機(jī)酸、不同碳氮比的培養(yǎng)條件下發(fā)酵性能的比較Fig.3 Performance comparisons of the solventogenic state Clostridium acetobutylicum in the media with certain concentration of organic acid and different carbon/nitrogen ratios

圖4 在不同碳氮比的培養(yǎng)條件下丙丁梭菌產(chǎn)丁醇占總?cè)軇┲械谋壤鼺ig.4 Ratios of butanol to total solvents produced by Clostridium acetobutylicum under various culture condition containing different carbon/nitrogen ratios

2.3 含碳氮比不同的生物質(zhì)原料丁醇發(fā)酵性能的比較

采用添加不同質(zhì)量濃度酵母浸粉的葡萄糖培養(yǎng)基，研究了丙丁梭菌在不同碳氮比的培養(yǎng)條件下產(chǎn)酸期和產(chǎn)溶劑期的發(fā)酵性能，了解了培養(yǎng)基的碳氮比對丙丁梭菌產(chǎn)酸、相轉(zhuǎn)型以及所產(chǎn)丁醇占總?cè)軇┍壤确矫娴挠绊?。為驗證上述結(jié)論能否應(yīng)用于成分復(fù)雜的生物質(zhì)原料，采用玉米粉、木薯粉和豆餅粉三種碳氮比質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異很大的原料，進(jìn)行丙酮丁醇發(fā)酵。表1為各原料的淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。其中玉米粉的淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)均比較充足，計算出的碳氮比為21.9 mol/mol；木薯粉是典型的高碳低氮型原料，碳氮比為118.8 mol/mol；豆餅粉含氮量高但淀粉質(zhì)量分?jǐn)?shù)太低，需要額外補(bǔ)充葡萄糖，補(bǔ)充后碳氮比為6.5 mol/mol。

表1 各原料的淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Contentsofstarch and protein in each fermentation substrates

實驗結(jié)果見表2。含中、低碳氮比的原料（玉米粉和豆餅粉），發(fā)酵過程耗時短，平均產(chǎn)氣速率快，相轉(zhuǎn)型順利，但發(fā)酵過程生產(chǎn)的副產(chǎn)物量高。玉米粉為原料時，丙酮和乙醇產(chǎn)量分別達(dá)到6.30、1.83 g/L，丁醇比例只占59.5%。豆餅粉為原料時整個發(fā)酵過程有機(jī)酸積累量一直很高，最高值達(dá)到6.29 g/L，發(fā)酵結(jié)束時仍殘留3.99 g/L。雖未出現(xiàn)“酸崩潰”現(xiàn)象，但溶劑產(chǎn)量明顯受到影響，僅為16.33 g/L，其中丁醇終產(chǎn)量只有9.92 g/L，并未達(dá)到產(chǎn)物抑制質(zhì)量濃度（12～14 g/L丁醇），且所占比例與玉米原料的水平相似，為60.7%。而高碳低氮的原料（如木薯粉），菌體平均產(chǎn)氣速率低，相轉(zhuǎn)型出現(xiàn)延滯導(dǎo)致發(fā)酵時間延長至66 h。但轉(zhuǎn)型完成后，副產(chǎn)物溶劑產(chǎn)量相對較低，丁醇產(chǎn)量占到總?cè)軇┊a(chǎn)量的63.8%。在其他研究中，也發(fā)現(xiàn)高碳低氮生物質(zhì)為原料的發(fā)酵，耗時長，溶劑產(chǎn)量低，但丁醇占總?cè)軇┑谋壤芨?。王風(fēng)芹等利用玉米秸稈水解液發(fā)酵丙丁梭菌，發(fā)酵時長60 h，總?cè)軇┊a(chǎn)量6.72 g/L，但丁醇產(chǎn)量有4.54 g/L，占總?cè)軇┑?7.5%[11]。以上結(jié)果基本證實了在葡萄糖培養(yǎng)基中總結(jié)出的不同碳氮比對丁醇發(fā)酵各階段發(fā)酵性能的影響效應(yīng)。接著，通過在產(chǎn)酸期補(bǔ)加少量酵母浸粉（添加量2.5 g/L），降低木薯原料碳氮比至83.6 mol/mol，在前面總結(jié)出的適中范圍內(nèi)（46.7～93.4 mol/mol）。 結(jié)果發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵過程的平均產(chǎn)氣速率明顯提高，相轉(zhuǎn)型順利完成，發(fā)酵時間縮短至50 h，總?cè)軇┊a(chǎn)量提高到21.10 g/L，其中丁醇所占比例依然維持在64.5%的較高水平。

表2 采用含不同碳氮比原料的丁醇發(fā)酵性能比較Table 2 Fermentation performances on different substrates containing various carbon/nitrogen ratio

生物質(zhì)原料成分復(fù)雜，其中所含氮源和碳源并不能像酵母浸粉和葡萄糖一樣，能被菌體迅速、完全的吸收利用。但根據(jù)在葡萄糖培養(yǎng)基中總結(jié)出的不同碳氮比對丁醇發(fā)酵性能的影響效應(yīng)，基本能在不同碳氮比生物質(zhì)原料的丁醇發(fā)酵中體現(xiàn)出來。以上述結(jié)論可以作為參考用于調(diào)配生物質(zhì)原料的碳氮比，改善以生物質(zhì)、尤其是碳氮比失衡的一類原料的丁醇發(fā)酵性能，提高原料利用效率。

3 結(jié)語

利用含不同質(zhì)量濃度酵母浸粉的葡萄糖培養(yǎng)基，以及3種碳氮比不同的生物質(zhì)原料進(jìn)行丁醇發(fā)酵，研究了原料的碳氮比對丁醇發(fā)酵不同時期發(fā)酵性能的影響，得到如下結(jié)論：

1)適中的碳氮比（46.7～93.4 mol/mol）有利于菌體在發(fā)酵產(chǎn)酸期能以正常速度生長，不會造成有機(jī)酸的過度積累，發(fā)酵能順利而平穩(wěn)進(jìn)入產(chǎn)溶劑期，為后面溶劑的正常生產(chǎn)提供了保證。

2)較高的碳氮比（93.4～186.7 mol/mol）既不影響菌體在產(chǎn)溶劑期的丁醇產(chǎn)量，又可以有效抑制副產(chǎn)物溶劑丙酮和乙醇的合成，從而獲得較高的丁醇/總?cè)軇┍壤?/p>

3)上述結(jié)果可作為參考，用于調(diào)配不同生物質(zhì)原料的碳氮比，可改善碳氮比失衡的生物質(zhì)為原料的丁醇發(fā)酵性能，提高原料的利用效率。

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