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    高效陰離子交換色譜積分脈沖安培法測(cè)定藍(lán)藻細(xì)胞培養(yǎng)液中的蔗糖和甘油葡糖苷*

    2014-12-24 05:20:18梁文輝法蕓王明林
    化學(xué)分析計(jì)量 2014年1期
    關(guān)鍵詞:安培藍(lán)藻檢測(cè)法

    梁文輝,法蕓,王明林

    (1.山東農(nóng)業(yè)大學(xué),食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東泰安 271018;2.中國(guó)科學(xué)院青島生物能源與過(guò)程研究所,生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,山東青島 266101)

    在小分子糖類碳源中,蔗糖可由高等植物通過(guò)光合作用直接合成,被認(rèn)為是自然界最豐富的二糖;同時(shí)蔗糖結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單,很多微生物可以利用,是一種較為理想的碳源。又因?yàn)樗{(lán)藻具有高光效,生長(zhǎng)速度快,遺傳操作體系相對(duì)成熟,適用于大通量的基因工程改造等一系列優(yōu)勢(shì),通過(guò)代謝工程改造藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)蔗糖并提供給大腸桿菌等微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物燃料,必將加速整個(gè)生物燃料的產(chǎn)業(yè)化進(jìn)程,相關(guān)的研究意義重大[1,2]。

    在藍(lán)細(xì)菌相關(guān)研究中,蔗糖、甘油葡糖苷(GG)等組分的準(zhǔn)確測(cè)定是一個(gè)重要環(huán)節(jié)。蔗糖的測(cè)定方法較多,如近紅外光譜法[3]、高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法[4]等。測(cè)定GG的方法包括核磁共振碳譜[5],氣液色譜[6]和酶技術(shù)[7]等。以上方法或者操作復(fù)雜,或者使用毒性較大的淋洗液。高效液相色譜在分離含有低濃度蔗糖和GG的樣品時(shí),RPC柱和IMPC柱的分離能力受到限制;氨基鍵合硅膠填料的色譜柱和乙腈–水作流動(dòng)相能夠?qū)G和二糖很好地分離,但是無(wú)法分離一些重要的己糖[8]。

    高效陰離子交換色譜脈沖安培檢測(cè)法是糖類檢測(cè)的有效方法,適用于單糖、二糖、小分子寡糖的測(cè)定[9],具有靈敏度高、選擇性好等特點(diǎn)。這種方法已被廣泛用于食品中糖類的測(cè)定[10–17]、煙草[18]和藥物中糖類的測(cè)定[19]。筆者對(duì)離子色譜脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定藍(lán)藻細(xì)胞培養(yǎng)液中的蔗糖和GG進(jìn)行了研究。該方法前處理簡(jiǎn)單、選擇性好、靈敏度高。

    1 實(shí)驗(yàn)部分

    1.1 主要儀器與試劑

    離子色譜儀:ICS–3000型,配備雙泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、電化學(xué)檢測(cè)器,美國(guó)賽默飛世爾科技有限公司;

    超純水制備儀:Milli-Q?Advantage A10型,法國(guó)Millipore公司;

    氫氧化鈉溶液:質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%,比利時(shí)Acros Organics公司;

    蔗糖標(biāo)準(zhǔn)品:純度不小于99.5%,國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)研究中心;

    GG標(biāo)準(zhǔn)品:純度不小于99.5%,德國(guó)Bitop AG公司;

    藍(lán)藻培養(yǎng)液樣品:自制;

    實(shí)驗(yàn)用水為電阻率18 MΩ·cm的超純水,進(jìn)樣前經(jīng)過(guò)0.22 μm水相濾膜過(guò)濾。

    1.2 標(biāo)準(zhǔn)品的配制

    準(zhǔn)確稱取0.01 g(精確至0.001 g)經(jīng)過(guò)干燥至恒重的蔗糖,用超純水定容于10 mL容量瓶中,制得1 000 mg/L的蔗糖標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。同法配制相同濃度的GG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

    用移液槍分別準(zhǔn)確吸取1,5,10,20,50,100,200,500,1000 μL上述兩種標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液,用超純水定容于10 mL容量瓶中,質(zhì)量濃度分別為0.1,0.5,1.0,2.0,5.0,10.0,20.0,50.0 mg/L。

    1.3 樣品前處理

    經(jīng)過(guò)600 mmol/L NaCl鹽脅迫后每隔24 h取樣2 mL藍(lán)藻培養(yǎng)液,以12 000 r/min速度離心5 min,取上清液。將上清液稀釋10倍后取約10 mL溶液用0.22 μm水相濾膜過(guò)濾,過(guò)IC–RP柱除去蛋白、色素等有機(jī)雜質(zhì)。

    IC–RP柱(1.0 mL,Agela Technologies)使用前須先經(jīng)5 mL甲醇、10 mL水活化,放置20 min后使用。當(dāng)樣品溶液通過(guò)該柱時(shí),前面3 mL棄去,后面溶液待檢測(cè)。

    1.4 色譜條件

    色譜柱:CarboPac MA1分析柱和保護(hù)柱(美國(guó)Thermo Scientific公司);淋洗液:800 mmol/L氫氧化鈉溶液等度洗脫;進(jìn)樣體積:25 μL;流量:0.4 mL/min;柱溫:30℃;利用Chromeleon 6.8 色譜軟件自動(dòng)控制和數(shù)據(jù)處理。積分脈沖安培檢測(cè);金工作電極;Ag/AgCl參比電極;檢測(cè)電位波形見(jiàn)表1。

    表1 檢測(cè)電位波形

    2 結(jié)果與討論

    2.1 淋洗液濃度的選擇

    分別考察300,500,800,1 000 mmol/L氫氧化鈉淋洗液對(duì)蔗糖和GG分離效果的影響,結(jié)果表明:淋洗液濃度在300,500 mmol/L時(shí),蔗糖和GG已經(jīng)能夠分開(kāi),但分離時(shí)間較長(zhǎng)(超過(guò)1 h);淋洗液濃度為800 mmol/L時(shí),蔗糖與GG可在30 min內(nèi)實(shí)現(xiàn)完全分離;淋洗液濃度為1 000 mmol/L時(shí),蔗糖與GG分離效果不理想。所以選擇800 mmol/L的氫氧化鈉溶液作為淋洗液。

    2.2 色譜柱的選擇

    使用HPLC在分離含有低濃度蔗糖和GG的樣品時(shí),RPC柱和IMPC柱的分離能力受到限制[8]。CarboPac PA10色譜柱能分開(kāi)蔗糖和GG,但檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí),有雜峰和蔗糖的色譜峰重合,干擾了蔗糖檢測(cè)。利用CarboPac MA1柱分離效果較好,檢測(cè)實(shí)際樣品時(shí),蔗糖和其它未知組分無(wú)共淋洗現(xiàn)象發(fā)生。蔗糖和GG標(biāo)準(zhǔn)品的分離情況如圖1 所示。

    圖1 蔗糖和GG標(biāo)準(zhǔn)品的色譜圖

    2.3 線性方程與檢出限

    逐級(jí)稀釋蔗糖、GG標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液分別得到0.10,0.50,1.00,2.00,5.00,10.00,20.00,50.00 mg/L的蔗糖和GG混合標(biāo)準(zhǔn)溶液,進(jìn)樣量為25 μL,以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度與對(duì)應(yīng)的色譜峰面積進(jìn)行線性回歸得線性方程。線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限(S/N=3)見(jiàn)表2。由表2可知,蔗糖和GG線性相關(guān)系數(shù)均大于0.999 9,檢出限分別為0.15 mg/L和0.03 mg/L。

    表2 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限

    2.4 方法精密度

    用2 mg/L的蔗糖和GG混合標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)進(jìn)樣8次,測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表3。由表3可知,蔗糖和GG 8次測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為0.755%和1.694%,表明本法測(cè)量精密度較高。

    表3 精密度試驗(yàn)結(jié)果

    2.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)

    取藍(lán)藻培養(yǎng)液樣品,按照1.3方法處理,在1.4色譜條件下測(cè)定,然后在樣品中分別加入1.0,10.0,20.0 mg/L的蔗糖和GG混合標(biāo)準(zhǔn)品,重復(fù)試驗(yàn),測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。由表4可知,蔗糖和GG的平均加標(biāo)回收率為99.13%和94.23%,表明本法測(cè)量準(zhǔn)確度較高。

    表4 加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

    2.6 樣品測(cè)定

    應(yīng)用此方法測(cè)定5種不同時(shí)間間隔取樣的藍(lán)藻細(xì)胞培養(yǎng)液中的蔗糖和GG,樣品中蔗糖和GG的含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表5,樣品色譜圖如圖2所示。由圖2可見(jiàn),蔗糖和GG相互之間及其與樣品基底成分分離良好,測(cè)定無(wú)干擾。

    表5 不同藍(lán)藻培養(yǎng)液樣品中的蔗糖和GG含量 mg/L

    3 結(jié)語(yǔ)

    離子色譜脈沖安培檢測(cè)法測(cè)定藍(lán)藻培養(yǎng)液中的蔗糖和GG,最低檢測(cè)限分別達(dá)到0.03 mg/L和0.15 mg/L,比高效液相色譜蒸發(fā)光散射檢測(cè)法測(cè)定蔗糖的最低檢測(cè)線14 mg/L要低[4]。測(cè)量精密度和準(zhǔn)確度滿足要求,可用于藍(lán)藻細(xì)胞培養(yǎng)液中蔗糖和GG的同時(shí)測(cè)定。

    圖2 不同藍(lán)藻細(xì)胞培養(yǎng)液中蔗糖和GG的色譜圖

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