國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口檸檬酸消毒劑殺細(xì)菌芽胞效果的比較研究

馬永，郭偉鵬，周錦禎，林秀華，吳清平

（1.福建生物工程職業(yè)技術(shù)學(xué)院食品與生物工程系，福建福州350700；2.省部共建華南應(yīng)用微生物國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東廣州510070；3.廣東省微生物研究所，廣東廣州510070；4.廣東省微生物分析檢測(cè)中心，廣東廣州510070）

檸檬酸復(fù)合消毒劑，由有機(jī)氯、檸檬酸、硫酸鈉等成份混合組成，使用時(shí)根據(jù)不同需求，用水溶解并稀釋至需要的濃度即可.對(duì)口蹄疫病毒、豬瘟病毒、豬水泡病毒、雞新城疫病毒、雞法氏囊病毒、大腸桿菌、葡萄球菌等病原微生物均具有顯著的殺滅作用.具有殺菌效果可靠、穩(wěn)定性好，腐蝕性小，使用安全、環(huán)保[1]等特點(diǎn)，而且產(chǎn)品刺激性氣味小.檸檬酸消毒劑與80℃溫度聯(lián)合用于透析機(jī)管路消毒取得很好的效果[2]，目前國(guó)內(nèi)醫(yī)院血透機(jī)所用的消毒劑基本上是國(guó)外品牌的檸檬酸消毒劑（如費(fèi)森檸檬酸消毒劑、貝朗檸檬酸消毒劑等），國(guó)內(nèi)研發(fā)出來的檸檬酸消毒劑與進(jìn)口產(chǎn)品相比價(jià)格優(yōu)勢(shì)明顯，但是消毒效果是否與其一樣，令人質(zhì)疑.為了了解其殺菌效果，本研究以國(guó)外品牌的檸檬酸消毒劑（費(fèi)森、貝朗）做為對(duì)照，按照《消毒技術(shù)規(guī)范》（衛(wèi)生部2002 版）殺菌性能測(cè)試的要求進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室殺菌試驗(yàn)，以評(píng)估國(guó)產(chǎn)檸檬酸殺菌效果.

細(xì)菌芽胞是有些細(xì)菌（多為桿菌）在一定條件下細(xì)胞質(zhì)高度濃縮脫水所形成的一種抗逆性很強(qiáng)的球形或橢圓形的休眠體，是整個(gè)生物界中抗逆性最強(qiáng)的生命體[3]，是否能消滅芽孢是衡量各種消毒滅菌手段的最重要的指標(biāo).選擇細(xì)菌芽胞來評(píng)價(jià)進(jìn)口和國(guó)產(chǎn)檸檬酸消毒劑的殺菌效果具有很重要的意義.

1 材料與方法

1.1 材料[4]

1）菌懸液和菌片的制備.取枯草芽胞桿菌（Ba?cillus subtilis ATCC9372）代數(shù)為第4-6代；

2）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；

3）標(biāo)準(zhǔn)硬水：CaCl2：3.04g/100mL，MgCl2，1.39g/100 mL，用來配置待檢消毒劑；

4）PBS：0.03 mol/L磷酸鹽緩沖液；

5）中和劑：0.5 g/100mL 硫代硫酸鈉、1g/100mL吐溫80的PBS溶液；

6）刻度試管：1.0、5.0、10.0mL等；

7）載體：將醫(yī)用止血鉗截?cái)?，取其由軸至齒端部分，按照《消毒技術(shù)規(guī)范》（衛(wèi)生部2002版）規(guī)定方法進(jìn)行脫脂處理.

8）消毒劑溶液的配制：用無菌標(biāo)準(zhǔn)硬水稀釋制得25%和50%國(guó)產(chǎn)環(huán)凱牌檸檬酸消毒劑、費(fèi)森檸檬酸消毒劑（25%）、貝朗檸檬酸消毒劑（50%）.

1.2 方法

1）芽胞懸液.取B.subtilis（ATCC 9372）液體培養(yǎng)物3 mL，接種于羅氏瓶中營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基表面，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)，培養(yǎng)8 d.用接種環(huán)取菌樣少許，采用孔雀綠法進(jìn)行芽胞染色，并在顯微鏡下進(jìn)行鏡檢.當(dāng)芽胞形成率達(dá)95%以上時(shí)，即可進(jìn)行芽孢懸液的制備.用無菌水30 mL輕輕推刮下菌苔，集中于一含玻璃珠的無菌三角瓶中，振搖30min，分散培養(yǎng)物，制成均勻的懸液.將盛裝上述懸液的三角瓶置于45 ℃水浴中24 h，分散成單個(gè)芽胞.最后，將三角瓶放于80 ℃水浴中10 min，以殺滅殘余的細(xì)菌繁殖體，待冷至室溫后，即為芽胞懸液[5].將芽孢懸液與含3g/100 mL 小牛血清白蛋白溶液以等體積混合制成1×108～5×108 cfu/mL菌懸液，備用.

2）醫(yī)用染菌止血鉗的制備.模擬現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)用醫(yī)用止血鉗樣本：取醫(yī)用止血鉗由軸至齒端部分，進(jìn)行脫脂處理，經(jīng)壓力蒸汽滅菌后，烤干備用[4].

用無菌鑷子將止血鉗樣本齒面朝上，并固定在無菌支撐物上.用0.1mL定量無菌移液器，將0.02mL菌懸液（含量為2.5×107～2.5×108cfu/mL）滴染于齒部，用無菌L型鉑金絲涂勻，置37℃恒溫箱內(nèi)干燥備用[6]，菌片含菌量為5×105cfu/mL～5×106cfu/片.

3）中和劑鑒定試驗(yàn).設(shè)平行6 組試驗(yàn)，按《消毒技術(shù)規(guī)范》（衛(wèi)生部2002版）中規(guī)定的中和劑鑒定試驗(yàn)程序進(jìn)行[6].

4）懸液定量殺滅試驗(yàn).在80 ℃水浴條件下，吸取以上制備好芽胞菌懸液0.5 mL加入到4.5 mL消毒液試管內(nèi)（陽性對(duì)照為PBS）混勻.作用至規(guī)定時(shí)間，吸取0.5 mL 加于4.5 mL 中和劑試管中混勻，中和作用10 min.經(jīng)充分混合均勻，取樣進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)，計(jì)算殺滅對(duì)數(shù)值.試驗(yàn)重復(fù)3次[4].

5）醫(yī)療器械的消毒模擬現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn).將30個(gè)醫(yī)用止血鉗染菌樣本浸沒于10 mL已在80 ℃水浴中保溫5 min 的消毒液中進(jìn)行消毒處理.作用至規(guī)定時(shí)間，取出樣本,分別移入含10 mL 中和劑溶液的試管內(nèi).經(jīng)充分混合均勻，取樣進(jìn)行活菌培養(yǎng)計(jì)數(shù)[5]，以無菌蒸餾水代替消毒液，將兩個(gè)染菌載體依上同樣條件處理，然后與試驗(yàn)組載體同法接種、培養(yǎng)、觀察結(jié)果，作為陽性對(duì)照組.

以上試驗(yàn)結(jié)束后，將用過的同批次中和劑、采樣液、稀釋液接種培養(yǎng)基，進(jìn)行培養(yǎng)；另將未用過的同批培養(yǎng)基亦放入恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，作為陰性對(duì)照[4].

2 結(jié)果與分析

2.1 中和劑鑒定試驗(yàn)試驗(yàn)

經(jīng)檢測(cè)，所采用的中和劑，可有效中和檸檬酸消毒劑對(duì)試驗(yàn)菌的殘留作用，且該中和劑及其中和產(chǎn)物對(duì)試驗(yàn)菌生長(zhǎng)無不良影響，組間菌落數(shù)誤差小于15%，符合中和劑的要求（見表1）.

表1 消毒劑中和劑試驗(yàn)Tab.1 The result of neutralizer test of the disinfectant

2.2 懸液定量殺菌結(jié)果

通過3 次試驗(yàn)結(jié)果，三種檸檬酸消毒劑在測(cè)試時(shí)間15 min、試驗(yàn)溫度80 ℃均可以將菌全部殺死，達(dá)到100%殺菌率，殺菌效果基本一致，結(jié)果見表2.

2.3 醫(yī)療器械的消毒模擬現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)結(jié)果

通過30 次試驗(yàn)三種檸檬酸消毒劑在測(cè)試時(shí)間15min、試驗(yàn)溫度80 ℃醫(yī)療器械消毒模擬現(xiàn)場(chǎng)試驗(yàn)時(shí)，三種檸檬酸消毒劑均具有殺菌作用，符合要求，見表3.

表2 檸檬酸消毒劑懸液定量殺菌試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 The killing results of suspension quantitative germicidal of citric acid disinfectant

表3 檸檬酸消毒劑模擬現(xiàn)場(chǎng)殺菌試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 The killing results of simulated on-the-spot test of citric acid disinfectant

3 討論

血液透析機(jī)用于急慢性腎功能衰竭患者腎臟替代治療.將體內(nèi)血液引流至體外，經(jīng)透析器清除代謝廢物、維持病人體內(nèi)的電解質(zhì)和酸堿平衡；同時(shí)清除病人體內(nèi)過多的水分.它的消毒效果與病人的生命息息相關(guān)，目前血液透析機(jī)多采用進(jìn)口的檸檬酸消毒劑.

檸檬酸是檸檬酸消毒劑中的主要有效成份.檸檬酸水溶液在溫度大于80 ℃時(shí)其pH小于3，屬于強(qiáng)酸.細(xì)菌的生存都需要一個(gè)特定的pH，檸檬酸的酸性可改變細(xì)胞內(nèi)的pH 值，影響到細(xì)菌的正常代謝.顯酸性的高濃度氫離子也會(huì)改變細(xì)菌的生物活性，直接傷害到菌體細(xì)胞，從而引起細(xì)菌的死亡，而熱力也是促進(jìn)檸檬酸殺芽孢效果的一個(gè)重要因素.所以在常溫下檸檬酸并沒有殺芽孢效果，當(dāng)溫度加熱至大于80 ℃時(shí)，微生物受到熱力的作用，細(xì)胞活動(dòng)加速，其芽孢外殼的通透性也會(huì)改變.同時(shí)在熱力的作用下，檸檬酸溶液的分子運(yùn)動(dòng)也會(huì)改變，其滲透性也會(huì)增強(qiáng).所以在80 ℃及檸檬酸水溶液的共同作用下，檸檬酸消毒劑表現(xiàn)出優(yōu)秀的殺芽孢效果[6].

通過上述試驗(yàn)，其結(jié)果表明國(guó)產(chǎn)和進(jìn)口檸檬酸消毒效果沒有區(qū)別，完全可以取代進(jìn)口費(fèi)森和貝朗檸檬酸消毒劑.實(shí)驗(yàn)結(jié)果需要我們進(jìn)一步在血液透析機(jī)消毒實(shí)際工作中得到驗(yàn)證.

[1]林秋嬋,吳清平,鄧金花,等.比較兩種方法測(cè)定檸檬酸與熱力協(xié)同殺菌作用[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志,2013,30(2):103-105.

[2]劉學(xué)軍,陸文進(jìn),張凌.血液透析機(jī)消毒效果的臨床觀察[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志,2014,24(1):245-246;249.

[3]東秀珠,蔡妙英.常見細(xì)菌鑒定手冊(cè)[M].北京:科學(xué)教育出版社,2001.

[4]衛(wèi)生部衛(wèi)生法制與監(jiān)督司.消毒技術(shù)規(guī)范[M].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社,2002:83-93.

[5]李飛,陳羽.醋酸氯已定的殺菌效果[J].微生物雜志,2014,2(34)1:101-103.

[6]王曉,賴發(fā)偉,楊寧,等.檸檬酸與熱力協(xié)同消毒作用相關(guān)性能試驗(yàn)研究[J].中國(guó)消毒學(xué)雜志,2013,30(1):6-8.