用HPLC 分析對胍基苯甲酸鹽酸鹽含量的研究

曲秦，李宗霖，麻紀(jì)斌，陳雁，翟帆

(1.陜西新藥技術(shù)開發(fā)中心，陜西 西安 710075;2.西安市第五醫(yī)院，陜西 西安 710082)

對胍基苯甲酸鹽酸鹽是一種常用的醫(yī)藥工業(yè)中間體，為頂體蛋白酶的抑制劑［1］，用于合成抗胰腺炎藥物甲磺酸卡莫司他和萘莫司他，以及合成許多其他蛋白酶抑制劑。它們所含的胍基具有很強的生理活性，可在配基與受體及酶與底物間通過氫鍵作用形成特殊的相互作用，因此近些年對胍基化合物的研究日益深入。對胍基苯甲酸鹽酸鹽在抗生育領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用前景，有望發(fā)展成為避孕藥系列產(chǎn)品［2］。

對胍基苯甲酸化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，可溶性差，常以鹽酸鹽的形式用于藥物合成［3］。在對胍基苯甲酸鹽酸鹽合成中可能引入副產(chǎn)物及未反應(yīng)完全的反應(yīng)物，作為中間產(chǎn)品的控制需要提供準(zhǔn)確的檢測方法。

本文采用HPLC［4］法測定對胍基苯甲酸鹽酸鹽含量，具有操作方便、測定結(jié)果準(zhǔn)確可靠、檢出限好等優(yōu)點。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品和樣品均為自制;純凈水;乙腈，色譜純;醋酸，分析純。

Ag135 電子天平;Waters 高效液相色譜儀;PHS-3C 型精密pH 計;KQ-300VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器。

1.2 溶液配制

1.2.1 對照品溶液制備精密稱取對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品20.0 mg，置25 mL 量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1 mL 至新的10 mL 容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.2.2 供試品溶液制備精密稱取對胍基苯甲酸鹽酸鹽供試品10.0 mg，置50 mL 量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1 mL 至新的10 mL 容量瓶中，加流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得。

1.3 色譜條件

色譜柱為反相C18柱(250 mm ×4.6 mm);流動相為醋酸鹽緩沖液(pH =3.0)∶乙腈=70 ∶30(V/V);檢測波長251 nm;流速0.5 mL/min;進樣量20 μL，柱溫為30 ℃。理論板數(shù)按對胍基苯甲酸鹽酸鹽峰計算不低于2 000。主峰與雜質(zhì)峰的分離度＞1.5。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密稱取干燥至恒重的對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品100 mg，置50 mL 量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，再精密量取0. 5，1. 0，2. 0，3. 0，4.0，5.0，6.0 mL 分別置于10 mL 容量瓶中，用流動相稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，分別取供試品溶液各20 μL 進樣，以峰面積對濃度作標(biāo)準(zhǔn)曲線，見圖1。

圖1 對胍基苯甲酸鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of 4-guanidinobenzoic acid hydrochloride

以峰面積對濃度作線性回歸，得回歸方程y =7.346x + 2. 502 9，R2= 0. 999 3?？梢娫? ～30 μg/mL 范圍內(nèi)，峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

2 結(jié)果與討論

2.1 精密度實驗

精密量取對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品溶液，按上述色譜條件，分別重復(fù)測定5 次，結(jié)果見表1。

表1 精密度實驗結(jié)果Table 1 Results of precision experiment

由表1 可知，對胍基苯甲酸鹽酸鹽峰面積的RSD 值為1.35%，表明儀器精密度良好。

2.2 重現(xiàn)性實驗

精密稱取同一批樣品5 份，按供試品溶液制備方法平行處理并測定，結(jié)果見表2。

表2 重現(xiàn)性實驗結(jié)果Table 2 Results of reproducibility experiment

由表2 可知，對胍基苯甲酸鹽酸鹽峰面積的RSD 值為1.52 %，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3 穩(wěn)定性實驗

精密稱取同一批樣品制成供試液，分別于0，2，4，8，12 h 測定峰面積，結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性實驗結(jié)果Table 3 Results of stability experiment

由表3 可知，對胍基苯甲酸鹽酸鹽峰面積的RSD 值為2.44%，說明供試液在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 加樣回收率實驗

精密稱取已知含量(96.97%)的同一批對胍基苯甲酸鹽酸鹽樣品9 份，每份約20 mg，分別精密加入一定量的對照品制備供試品溶液，按色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表4。由表4 可知，回收率為99.45%，RSD=1.32%，表明加樣回收結(jié)果良好。

表4 回收率實驗結(jié)果(n=9)Table 4 Results of recovery experiment (n=9)

2.5 樣品測定

取對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品及3 批次樣品進行測定，按外標(biāo)法以峰面積計算含量，見圖2、圖3。

圖2 對胍基苯甲酸鹽酸鹽對照品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograph of reference of 4-guanidinobenzoic acid hydrochloride

圖3 對胍基苯甲酸鹽酸鹽樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatograph of sample of 4-guanidinobenzoic acid hydrochloride

由圖3 可知，3 批樣品的含量分別為95.1%，96.5%，95.7%。

3 結(jié)論

采用HPLC 方法檢測對胍基苯甲酸鹽酸鹽的含量，保留時間為4.688 min，與雜質(zhì)峰的分離度大于1.5，分離度良好，雜質(zhì)對對胍基苯甲酸鹽酸鹽的質(zhì)量檢測無干擾。在含量2 ～30 μg/mL 內(nèi)，線性關(guān)系很好，精密度、重現(xiàn)性和穩(wěn)定性良好，具有良好的準(zhǔn)確度和重現(xiàn)性。適用于對胍基苯甲酸鹽酸鹽工業(yè)生產(chǎn)的質(zhì)量控制。

［1］ 趙亞南，紀(jì)亞忠，呂加國，等. 頂體蛋白酶抑制劑4-胍基苯甲酸鹽對人精子功能的影響［J］. 第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2000，21(12):1149-1151.

［2］ 袁德祥，刁筱輝.4-羰基乙氧苯基-4-胍基苯甲酸酯鹽酸鹽對人精子頂體蛋白酶活性的影響［J］. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，1992，1(1):38-42.

［3］ 趙煜松，曾海霞. 對胍基苯甲酸鹽酸鹽質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究［J］.河北化工，2012，35(1):26-28.

［4］ 國家藥典委員會.中國藥典:二部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010.