用HPLC 測定羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯含量的研究

李宗霖，麻紀(jì)斌，曲秦，翟帆，舒泉湧，秦湫紅

(陜西新藥技術(shù)開發(fā)中心，陜西 西安 710075)

對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯是合成4-(4-胍基苯酰氧基)苯乙酸-N，N-二甲基氨基甲酰甲酯甲磺酸鹽(甲磺酸卡莫司他)的中間體，甲磺酸卡莫司他是日本小野藥品工業(yè)研究所開發(fā)的非肽類蛋白酶抑制劑，臨床用于慢性胰腺炎的治療，對(duì)胰蛋白酶、纖維蛋白溶酶、激肽釋放酶、凝血酶等有很強(qiáng)的抑制作用［1-2］。

對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯作為甲磺酸卡莫司他的重要中間體，它的控制方法對(duì)甲磺酸卡莫司他的合成具有很大影響［3-4］。由于合成工藝過程中可能引入副產(chǎn)物［5］，而且作為中間控制，快速、簡便、準(zhǔn)確的測定方法對(duì)于中間體的質(zhì)量控制具有不可替代的作用。本文建立了HPLC 檢測對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯的方法，為其工業(yè)生產(chǎn)質(zhì)量控制提供了有效依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯對(duì)照品，自制，含量98.5%;對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯，自制;純凈水;乙腈，色譜純。

Ag135 電子天平;Thermo Ultimate 3000 高效液相色譜儀;KQ-300VDE 型雙頻數(shù)控超聲波清洗器;VARIAN cary 50 紫外可見分光光度計(jì)。

1.2 溶液配制

1.2.1 對(duì)照品溶液的制備精密稱取對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯對(duì)照品10. 0 mg，置50 mL容量瓶中，加入乙腈/水(流動(dòng)相)適量，超聲5 min 使溶解后，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1 mL 至10 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

1.2.2 供試品溶液的制備精密稱取對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯樣品10.0 mg，置50 mL容量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲5 min 使溶解后，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。精密吸取1 mL 至10 mL容量瓶中，加流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的選擇

2.1.1 檢測波長的選擇以乙腈水為溶劑，配制對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯的溶液，在190～400 nm 波長下連續(xù)掃描，發(fā)現(xiàn)其最大吸收波長為275 nm。因此，確定檢測波長為275 nm。

2.1.2 流動(dòng)相配比的選擇在HPLC 檢測中，乙腈具有較低的吸光度，洗脫能力也較強(qiáng)，因此采用乙腈-水為流動(dòng)相。為確保對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯與雜質(zhì)的完全分離，以不同配比的乙腈與水進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，最后確定流動(dòng)相配比為:乙腈∶水=30∶70(V/V)。

2.1.3 色譜條件色譜柱為Thermo Syncronis C18柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-水(30∶70，V/V)，檢測波長為275 nm，流速1.0 mL/min，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量20 μL。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系精密稱取對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯對(duì)照品10.0 mg，置100 mL 容量瓶中，加流動(dòng)相適量，超聲5 min 使溶解，用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻，即為對(duì)照品儲(chǔ)備液。從對(duì)照品儲(chǔ)備液中精密量取0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL，用流動(dòng)相稀釋定容至10 mL 容量瓶中，得一系列不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液。分別精密量取20 μL 進(jìn)樣測定。以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯峰面積(mAU ×min)為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸，得方程:y = 0.971 0 x－0.002 3，R2= 0.999 9。對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯在0.2 ～1.0 μg 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.2.2 精密度實(shí)驗(yàn)精密量取對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯對(duì)照品溶液，按上述色譜條件，分別重復(fù)測定5 次，結(jié)果見表1。

表1 精密度考察結(jié)果Table 1 Results of precision experiment

由表1 可知，對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯峰面積的RSD 為1.69%，表明儀器精密度良好。

2.2.3 重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批樣品5 份，按供試品溶液制備方法平行處理并測定，結(jié)果見表2。

表2 重現(xiàn)性考察結(jié)果Table 2 Results of repeatability experiment

由表2 可知，對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯峰面積的RSD 為2.23%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.2.4 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密稱取同一批樣品，制成供試液，分別于0，2，4，8，12 h 測定峰面積，結(jié)果見表3。

表3 穩(wěn)定性考察結(jié)果Table 3 Results of stability experiment

由表3 可知，對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯峰面積的RSD 為2.27%，說明供試液在12 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2. 5 加樣回收率實(shí)驗(yàn)精密稱取已知含量(97.5%)的同一批對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯樣品9 份，每份約0.10 g，分別精密加入一定量的對(duì)照品，制備成供試品溶液后，精密量取5.0 mL，置于100 mL 容量瓶中，按色譜條件測定，結(jié)果見表4。

表4 回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果(n=9)Table 4 Results of recovery experiment (n=9)

2.3 樣品測定

取對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯及3批次樣品，按外標(biāo)法以峰面積計(jì)算含量，結(jié)果見圖1、圖2。

圖1 對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯對(duì)照品色譜圖 Fig.1 The chromatogram of reference of N，N- dimethylcarbamoylmethyl-p-hydroxyphenylacetate

圖2 對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯樣品色譜圖Fig.2 The chromatogram of sample of N，Ndimethylcarbamoylmethyl-p-hydroxyphenylacetate

3 結(jié)論

采用HPLC 法分析對(duì)羥基苯乙酸-N，N-二甲氨基甲酰甲酯含量，線性關(guān)系良好，主要成分和雜質(zhì)分離完全，分析時(shí)間短，精密度和重現(xiàn)性高，具有快速、簡便、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，適用于工業(yè)生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制和產(chǎn)品的質(zhì)量分析。

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