響應(yīng)面優(yōu)化酶法提取紫菜多糖工藝研究

劉敏，張淑平

(1.上海理工大學(xué) 醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093;2.上海理工大學(xué) 理學(xué)院，上海 200093)

紫菜多糖的含量由于品種、生長環(huán)境和生長季節(jié)等不同而有很大差別。紫菜多糖主要由巖藻糖、半乳糖、甘露糖、葡萄糖和木糖組成，是一種含糖醛酸的酸性異多糖。研究表明，紫菜多糖具有多種生物活性，具有很大的發(fā)展空間［1-3］。

多糖的傳統(tǒng)提取方法是水提法，已廣泛應(yīng)用，但具有耗時長、提取率低等缺點［4］。伴隨著多糖的深入研究，酶法提取多糖因其具有快速、高效、反應(yīng)時間短和易于控制等諸多優(yōu)點而被采用。

本研究以紫菜多糖得率為評價指標(biāo)，酶添加量、提取溫度、提取時間和pH 為影響因素，采用響應(yīng)面分析法［5-7］優(yōu)化酶法提取工藝，確定最優(yōu)工藝參數(shù)，為紫菜多糖的應(yīng)用和發(fā)展提供理論支持。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

纖維素酶(U/g ＞150 000)，棗莊市杰諾生物酶有限公司;紫菜;苯酚、濃硫酸、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純。

FA20O4N 型電子天平;HY3-01 型電熱恒溫水浴鍋;FD-2 型冷凍干燥機;UV-160O 紫外可見分光光度計;SHZ-D 循環(huán)水式真空泵。

1.2 實驗方法［8-12］

紫菜→烘干→粉碎→紫菜粉→加水→調(diào)節(jié)pH→加纖維素酶→水浴→90 ℃滅酶10 min→抽濾→濃縮(旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)40 min，50 ℃)→冷凍干燥→產(chǎn)品。

精確稱取紫菜干粉2 g，加入120 mL 蒸餾水。纖維素酶用量為1.5%，提取溫度為50 ℃，提取時間為60 min，pH 為5.0。

多糖提取液稀釋50 倍，以苯酚-硫酸法測定其多糖含量。紫菜多糖的得率按下式計算:

其中，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y = 12. 7x－0.010 3，A 為吸光度值，C 為多糖濃度，V 為溶液體積，m 為原料質(zhì)量，50 為稀釋倍數(shù)。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶用量對紫菜多糖得率的影響

酶用量對紫菜多糖得率的影響結(jié)果見圖1。

圖1 酶用量對紫菜多糖得率的影響Fig.1 Effect of enzyme loading on polysaccharide yield

由圖1 可知，纖維素酶用量在0.5% ～1.5%時，紫菜多糖得率隨酶用量的增大而上升;酶用量達(dá)到1. 5% 后，多糖得率基本趨于水平;酶用量為1.5%時，多糖得率達(dá)到最大，為12.61%。酶濃度過高，可能會抑制酶的作用［13-14］。因此，1.5%為最佳酶用量。

2.2 提取溫度對紫菜多糖得率的影響

不同溫度對多糖得率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對紫菜多糖得率的影響Fig.2 Effect of temperature on polysaccharide yield

由圖2 可知，溫度在40 ～50 ℃時，紫菜多糖得率隨著溫度的升高而增大，50 ℃時，達(dá)到最大，為13.52%;溫度在50 ～65 ℃時，紫菜多糖得率隨著溫度的升高而降低。因此，50 ℃為最佳溫度。

2.3 提取時間對紫菜多糖得率的影響

時間對多糖得率的影響見圖3。

由圖3 可知，在20 ～60 min，紫菜多糖得率隨時間延長而增加，60 min 時達(dá)到最大，為12. 79%。60 ～100 min，紫菜多糖隨著時間的延長而降低。究其原因可能是:由于時間的延長，導(dǎo)致紫菜粘度增大，反而不利于紫菜多糖的提取。因此，60 min 為最佳酶解時間。

圖3 提取時間對紫菜多糖得率的影響Fig.3 Effect of hydrolysis time on polysaccharide yield

2.4 pH 對紫菜多糖得率的影響

不同pH 對多糖得率的影響見圖4。

圖4 pH 對紫菜多糖得率的影響Fig.4 Effect of pH on polysaccharide yield

由圖4 可知，紫菜多糖得率隨著pH 的增大先增加后降低。pH 在4.0 ～5.0 時，紫菜多糖得率隨之增加，pH 為5.0 時達(dá)到最大，為23.51%;pH 在5.0 ～6.0 時，紫菜多糖得率隨之降低。因此，5.0 為最佳pH。

2.5 響應(yīng)面實驗結(jié)果［15］

根據(jù)單因素實驗結(jié)果，采用Design-Expert 8.5響應(yīng)面實驗設(shè)計，選擇纖維素酶用量(W/W)、提取溫度、提取時間、pH(W/V)4 個因素為影響因素，以紫菜多糖的得率為響應(yīng)值，因素水平見表1，結(jié)果見表2。

表1 響應(yīng)面實驗設(shè)計Table 1 Experimental design for RSM

表2 響應(yīng)面分析實驗及實驗結(jié)果Table 2 Program and experimental results of RSA

應(yīng)用Design-Expert 8.5 對表2 中實驗數(shù)據(jù)分析，得出紫菜多糖得率的二次回歸方程為:

表3 為紫菜多糖得率的方差分析。由表3 可知，回歸方程的P ＜0.01，說明模型高度顯著。其中一次項B 的P=0.002 3 ＜0.01，表明溫度對紫菜多糖得率有極顯著影響;B2、C2、D2的P 值均小于0.05，表明因素對多糖得率的影響不是簡單的線性關(guān)系;失擬項P=0.069 0 ＞0.05，表明擬合度較好，該響應(yīng)面能夠較真實地反映實驗結(jié)果。

表3 方差分析表Table 3 Analysis of variance

根據(jù)上述回歸方程做出立體分析圖和等高線圖，見圖5 ～圖7。

圖5 酶用量、溫度立體分析圖和相應(yīng)等高線圖Fig.5 Three-dimensional chart and corresponding contour plot for effects of enzyme loading and temperature

由圖5 可知，隨著酶用量和溫度的增大，紫菜多糖得率先提高后下降。酶用量在1.2% ～1.8%，溫度在47 ～55 ℃時，紫菜多糖得率較高。

圖6 顯示酶用量和時間對紫菜多糖得率的交互作用影響。立體分析圖可以看出時間和酶用量對紫菜多糖得率的影響均呈拋物線趨勢。隨著酶用量和時間的增大，紫菜多糖得率隨之先提高后下降。由等高線圖可以看出，酶用量在1.2% ～1.8%之間，時間在55 ～65 min 之間時，紫菜多糖得率達(dá)到最大。由于等高線圖中，等高線形狀接近圓形，說明A、D 兩個因素交互作用不明顯。

圖6 酶用量、時間立體分析圖和相應(yīng)等高線圖Fig.6 Three-dimensional chart and corresponding contour plot for effects of enzyme loading and extraction time

圖7 溫度、pH 立體分析圖和相應(yīng)等高線圖Fig.7 Three-dimensional chart and corresponding contour plot for effects of temperature and pH

由圖7 可知，隨著溫度和pH 的增大，紫菜多糖得率隨之先提高后下降。當(dāng)溫度在49 ～53 ℃，pH在4.7 ～5.3 時，紫菜多糖得率達(dá)到最大。

圖8 溫度、時間立體分析圖和相應(yīng)等高線圖Fig.8 Three-dimensional chart and corresponding contour plot for effects of temperature and time

由圖8 可知，隨著溫度和時間的增大，紫菜多糖得率先提高后下降。當(dāng)溫度在49 ～53 ℃，時間在55 ～65 min 時，紫菜多糖得率達(dá)到最大。

2.6 驗證實驗

采用軟件分析得到纖維素酶輔助提取紫菜多糖的最佳酶用量為1.48%，溫度為51. 11 ℃，pH 為5.01，提取時間為60.48 min，紫菜多糖得率軟件預(yù)測值為22.95%。選擇最佳酶用量為1.5%，溫度為51 ℃，pH 為5.0，提取時間為60 min，進(jìn)行3 次平行實驗進(jìn)行驗證，結(jié)果多糖得率為19.46%，與預(yù)測值22.95%非常接近，說明本實驗優(yōu)化結(jié)果是可行的。

3 結(jié)論

纖維素酶輔助提取紫菜多糖的最優(yōu)工藝條件為:最佳酶用量為1.5%，溫度為51 ℃，pH 為5.0，提取時間為60 min。在此條件下，多糖得率為19.46%。

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