過氧化氫誘導(dǎo)的奶牛乳腺上皮細(xì)胞氧化損傷模型的建立

金 鹿 閆素梅 史彬林 石惠宇 郭曉宇 李俊良

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，呼和浩特 010018)

氧化應(yīng)激是指細(xì)胞暴露于高濃度氧分子或氧的化學(xué)衍生物而引起的細(xì)胞損傷［1］。當(dāng)機(jī)體遭受到體內(nèi)外各種有害刺激時(shí)，氧化系統(tǒng)和抗氧化系統(tǒng)平衡失調(diào)，自由基的產(chǎn)生量會遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過機(jī)體的清除能力，抗氧化系統(tǒng)不能及時(shí)的清除就會導(dǎo)致過多的自由基，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激［2］。奶牛由于泌乳期間的高代謝率，往往會產(chǎn)生大量的活性氧(reactive oxygen species，ROS)，導(dǎo)致乳腺的氧化應(yīng)激，尤其對于高產(chǎn)奶牛［3］。奶牛乳腺上皮細(xì)胞(bovine mammary epithelial cells，BMEC)是乳腺組織的主要構(gòu)成細(xì)胞，是乳脂和乳蛋白合成與分泌的重要場所，其細(xì)胞的生物合成能力決定了奶牛乳腺的產(chǎn)奶能力［4］。由于奶牛泌乳期間代謝旺盛，BMEC是乳腺組織受到氧化應(yīng)激首先攻擊的細(xì)胞［5］。因此，BMEC是建立奶牛氧化應(yīng)激模型的理想組織細(xì)胞，建立一個(gè)成功可靠的BMEC氧化應(yīng)激模型，對于揭示氧化應(yīng)激機(jī)制、研究有效的抗氧化措施、提高抗氧化功能和產(chǎn)奶性能具有重要的意義。過氧化氫(hydrogen peroxide，H2O2)是一種重要的活性氧，極易穿過細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)亞鐵離子(Fe2+)通過Fenton反應(yīng)形成高活性的自由基，導(dǎo)致一系列反應(yīng)，因H2O2容易獲得，性質(zhì)相對穩(wěn)定，操作簡單，是目前研究各類細(xì)胞氧化損傷的重要工具［1］。目前，以H2O2為應(yīng)激源構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型的報(bào)道中，關(guān)于H2O2作用濃度與時(shí)間的 差 別 較 大。 韓 飛 等［6］用 10、100 和1 000μmol/L H2O2作用人肝癌細(xì)胞(HepG2)4 h后，結(jié)合細(xì)胞存活率及對DNA損傷程度結(jié)果，選擇100μmol/L作為HepG2細(xì)胞氧化模型的適宜濃度。彭亮等［7］選用人的臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞為試驗(yàn)材料，最終選擇1 000μmol/L H2O2作用1 h來構(gòu)建其氧化損傷模型。由此可見，不同的細(xì)胞對于抵抗外界應(yīng)激源的反應(yīng)敏感程度不同，所以構(gòu)建氧化損傷模型使用的H2O2作用濃度與作用時(shí)間也不同?？梢?，目前大多數(shù)氧化應(yīng)激模型的建立都集中于肝細(xì)胞或者是醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的心肌細(xì)胞，對于BMEC的氧化應(yīng)激模型建立的研究鮮見，而關(guān)于建立BMEC氧化損傷模型的判別標(biāo)準(zhǔn)的研究則尚未見報(bào)道。鑒于此，本試驗(yàn)通過研究H2O2的作用濃度和作用時(shí)間對BMEC存活率和抗氧化指標(biāo)的影響，研究建立BMEC氧化損傷模型，為進(jìn)一步深入研究BMEC的氧化應(yīng)激機(jī)制和抗氧化措施奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

DMEM/F12培養(yǎng)基、胎牛血清、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白溶液、膠原酶Ⅱ、胰蛋白酶/乙二胺四乙酸(EDTA)、雙抗均購自美國Gibco公司;H2O2、表皮生長因子、氫化可的松、催乳素、兩性霉素B均購自美國Sigma公司;四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)均購自美國Amresco公司;谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)、過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 試劑配制

H2O2原液的配制方法:35%H2O2濃度約為10 mol/L。取l mL稀釋到10 mL，配制成濃度為1 mol/L(1 000 mmol/L)的H2O2原液，按照試驗(yàn)要求配制成不同濃度的H2O2貯備液(0、100、200、400、600、800和1 000 mmol/L)。在試驗(yàn)開始前，用不同濃度的H2O2貯備液配制成含不同濃度H2O2的細(xì)胞培養(yǎng)液，保證各濃度培養(yǎng)液中加入的H2O2溶液體積相等，使得細(xì)胞培養(yǎng)液中除H2O2濃度不同外，其他成分都相同。

細(xì)胞培養(yǎng)液的配制:將20μL不同濃度的H2O2貯備液加入到 19.98 mL的 DMEM/F12基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，使反應(yīng)體系培養(yǎng)液中H2O2作用濃度分 別 為 0、100、200、400、600、800 和1 000μmol/L。配制好的液體用0.22μm的過濾器過濾，每次換液時(shí)現(xiàn)配。

1.3 BMEC 的培養(yǎng)

奶牛乳腺組織取自于內(nèi)蒙古呼和浩特市北亞清真冷庫，采用膠原酶消化法獲得BMEC。具體為將采集的健康的黑白花奶牛乳腺組織迅速帶回實(shí)驗(yàn)室，減去外層組織，取里層組織塊裝入含3×雙抗的磷酸鹽緩沖液(PBS)的貯液瓶中，轉(zhuǎn)入超凈臺中經(jīng)含3×雙抗的PBS清洗3遍、75%醫(yī)用酒精(30 s)清洗1遍、含1×雙抗的PBS清洗3遍后，用眼科剪剪去乳腺組織塊的表面部分，于深層腺泡多的地方剪取1 mm3大小的小塊裝入5 mL的離心管中，充分剪碎后加入等體積的0.5%的膠原酶Ⅱ，置于37℃的培養(yǎng)箱中消化1 h，每隔20 min拿出輕輕搖晃離心管1次，使小組織塊充分消化。消化液用80目的細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，收集濾液于15 mL的離心管中，1 300 r/min離心5 min后，移去上清。然后用PBS重新懸浮細(xì)胞，1 300 r/min離心3 min后，再次吸棄上清，培養(yǎng)液重新懸浮細(xì)胞后接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中，置于培養(yǎng)箱(37℃、5%CO2)中培養(yǎng)。待原代細(xì)胞80%～90%貼壁長滿培養(yǎng)瓶瓶底時(shí)，用0.05%胰蛋白酶/EDTA消化傳代細(xì)胞。

將傳至第3代貼壁生長的BMEC接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板和60 mm培養(yǎng)皿中，加入含10%胎牛血清的DMEM/F12完全培養(yǎng)液(含1μg/mL氫化可的松、0.5%胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白硒鈉、10 ng/mL表皮生長因子、5μg/mL催乳素)直至80%～90%細(xì)胞貼壁后進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.4 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

本試驗(yàn)分2部分進(jìn)行。試驗(yàn)一采用單因子完全隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將第3代貼壁生長的BMEC隨機(jī)分為42個(gè)組，每個(gè)組10個(gè)重復(fù)。細(xì)胞中分別添加 0、100、200、400、600、800 和 1 000 μmol/L H2O2，使之分別作用 2、4、6、8、12 和 24 h，測定細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算存活率。其中，0μmol/L組為對照組。以細(xì)胞存活率為主要指標(biāo)初步篩選H2O2作用時(shí)間和作用濃度。

試驗(yàn)二是采用試驗(yàn)一篩選得出適宜H2O2作用時(shí)間(6 h)，采用單因子隨機(jī)試驗(yàn)設(shè)計(jì)，將第3代貼壁生長的BMEC隨機(jī)分為7組，每組6個(gè)重復(fù)，BMEC 中添加不同濃度的 H2O2(0、100、200、400、600、800 和 1 000 μmol/L)，使 H2O2作用于細(xì)胞6 h后，收集細(xì)胞和培養(yǎng)液測定抗氧化指標(biāo)，進(jìn)一步篩選使細(xì)胞發(fā)生氧化損傷的適宜H2O2作用濃度。其中，0μmol/L組為對照組。

1.5 樣品采集

細(xì)胞培養(yǎng)液樣品采集:BMEC培養(yǎng)6 h后，從每組的每個(gè)重復(fù)中吸取細(xì)胞培養(yǎng)液，分別收集于1.5 mL Eppendof管中，12 000 r/min 離心 10 min，收集上清液用于CAT和SOD活性的測定。

用于酶活性測定的細(xì)胞樣品采集:BMEC培養(yǎng)6 h后，棄上清，在每培養(yǎng)皿中加入1 mL PBS清洗貼壁生長的BMEC 2遍，棄去液體，加入動物細(xì)胞裂解液后放置于冰上冰浴30 min，用細(xì)胞刮板刮取貼壁細(xì)胞，收集細(xì)胞懸液到1.5 mL Eppendorf管中，4℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液用于細(xì)胞中GPx活性和MDA含量的測定。

1.6 測定指標(biāo)及方法

1.6.1 存活率

存活率采用噻唑藍(lán)(MTT)法測定，以吸光度值反映細(xì)胞的數(shù)量。將細(xì)胞懸液以1×104個(gè)/mL的密度接種于96孔培養(yǎng)板，按上述試驗(yàn)設(shè)計(jì)培養(yǎng)24 h后，各培養(yǎng)孔加入MTT(5 mg/mL)20μL;4 h后，棄上清液，甩板并拍干液體，每孔加入DMSO 100μL，用全自動酶標(biāo)儀設(shè)置程序振蕩10 min，而后檢測各孔490 nm波長下的吸光度值(OD490nm)。根據(jù)下列公式計(jì)算存活率。

1.6.2 抗氧化指標(biāo)

GPx活性采用二硫代二硝基苯甲酸法測定，CAT活性采用比色法測定;SOD活性采用黃嘌呤氧化酶法測定;MDA含量采用硫代巴比妥酸法測定，具體操作過程按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 試驗(yàn)數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)經(jīng)Excel進(jìn)行整理和計(jì)算，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS 9.0分析軟件的方差分析(ANOVA)程序進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)和多重比較，P＜0.05表示差異顯著，0.05＜P≤0.10 表示差異趨于顯著，P＞0.10表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 H 2O 2作用濃度和作用時(shí)間對BMEC數(shù)量的影響

由表1可見，在所有作用時(shí)間下，H2O2作用濃度對BMEC數(shù)量均有顯著的影響(P＜0.05)，并且隨著H2O2作用濃度的增加，細(xì)胞的吸光度值均依次顯著減小，即細(xì)胞數(shù)量顯著降低(P＜0.05)。與對照組相比，當(dāng)H2O2作用濃度為100μmol/L時(shí)，作用時(shí)間在2～8 h均未對細(xì)胞數(shù)量造成顯著影響(P＞0.10);作用 12和 24 h，細(xì)胞數(shù)量顯著減少(P＜0.05)，存活率分別為 93.62%和 92.48%。當(dāng)H2O2作用濃度增加到200～400μmol/L時(shí)，除4和8 h作用時(shí)間外，其他各作用時(shí)間的細(xì)胞數(shù)量均顯著低于對照組(P＜0.05)。當(dāng)H2O2作用濃度達(dá)到600μmol/L時(shí)，所有作用時(shí)間的細(xì)胞數(shù)量與對照組相比均顯著減少(P＜0.05)，2、4、6、8、12 和24 h 細(xì) 胞 存 活 率 分 別 為 87.30%、91.94%、79.79%、76.34%、60.00%和 49.27%，而且當(dāng)作用時(shí)間在6 h以上時(shí)，其細(xì)胞數(shù)量顯著低于0～400 μmol/L組(P＜0.05)。當(dāng) H2O2作用濃度增加到800、1 000μmol/L時(shí)，所有作用時(shí)間的細(xì)胞數(shù)量均急劇減少，顯著低于其他各組(P＜0.05)，細(xì)胞的存活率分別從2 h的57.54%和56.35%降低到24 h的38.11%和20.15%，細(xì)胞死亡率高達(dá)40%～80%。

隨著H2O2作用時(shí)間的延長，不同濃度H2O2組細(xì)胞數(shù)量呈不同的變化規(guī)律。H2O2作用4 h與作用2 h相比，所有濃度H2O2組細(xì)胞數(shù)量均呈升高趨勢;作用6～8 h，與4 h相比，所有濃度 H2O2組細(xì)胞數(shù)量均呈降低趨勢;然而，作用12～24 h，600～1 000μmol/L組的細(xì)胞數(shù)量隨著H2O2作用時(shí)間的延長逐漸減弱，而100～400μmol/L組的細(xì)胞數(shù)量隨著時(shí)間的延長反而升高。其中，細(xì)胞存活率在70%～80%范圍內(nèi)的H2O2作用濃度與作用時(shí)間分別是:800μmol/L H2O2作用細(xì)胞4 h、600μmol/L H2O2作用細(xì)胞6 h、600μmol/L H2O2作用細(xì)胞 8 h，細(xì)胞的存活率分別為 73.15%、79.79%和 76.34%。

“一帶一路”國家倡議的提出，必然需要大批復(fù)合型英語專業(yè)人才，這是復(fù)合型英語專業(yè)的人才培養(yǎng)的機(jī)遇和挑戰(zhàn)[3]?！耙粠б宦贰背h視野下國際貿(mào)易法律復(fù)合人才法律英語教學(xué)是以培養(yǎng)國際化人才為目標(biāo)的高端人才培養(yǎng)活動，因此，必須要以國際化的先進(jìn)的教學(xué)理念為指引，針對“一帶一路”建設(shè)現(xiàn)實(shí)需要，根據(jù)國際貿(mào)易實(shí)踐對貿(mào)易、外語、法律人才的新需求，及時(shí)調(diào)整人才培養(yǎng)模式和教學(xué)大綱，以素質(zhì)教育和能力本位教育理論為基礎(chǔ)，構(gòu)建了“一帶一路”建設(shè)“外語+”、“貿(mào)易+”、“法律+”人才培養(yǎng)的多維互動模式[4]，將國際化人才培養(yǎng)理念貫穿于法律英語教學(xué)的始終。

表1 H 2 O 2作用濃度和作用時(shí)間對BMEC數(shù)量的影響Table 1 Effects of concentration and action time of H2O2 on BMECs count OD490 nm

2.2 H 2 O 2作用濃度對BMEC抗氧化指標(biāo)的影響

由表2可見，隨著H2O2作用濃度升高，細(xì)胞GPx活性顯著下降(P＜0.05)，其中，以 600～1 000μmol/L組較低，顯著低于其他各組(P＜0.05)，但 600、800和 1 000 μmol/L 組之間無顯著差異(P＞0.10);對照組最高，顯著高于其他各組(P＜0.05);100、200和 400 μmol/L 組居中。

600～1 000μmol/L的H2O2作用濃度引起培養(yǎng)液CAT和SOD活性顯著下降(P＜0.05)，顯著低于其他各組，但600、800和1 000μmol/L組之間差異不顯著(P＞0.10);400μmol/L組的培養(yǎng)液CAT和SOD活性顯著低于對照組和100μmol/L組(P＜0.05)，與200μmol/L 組之間無顯著的差異(P＞0.10)。從總趨勢看，對照組的培養(yǎng)液CAT和SOD活性最高，100、200和400μmol/L組居中，600、800和1 000μmol/L組較低。

細(xì)胞MDA含量與上述GPx、CAT、SOD活性出現(xiàn)相反的變化規(guī)律。H2O2作用濃度為600～1 000μmol/L時(shí)，細(xì)胞MDA含量較高，顯著高于對照組及100～400μmol/L組(P＜0.05)，但這 3組比較無顯著的差異(P＞0.10);作用濃度為400μmol/L時(shí)，細(xì)胞MDA含量顯著高于對照組和100μmol/L組(P＜0.05)，但與 200 μmol/L 組之間無顯著的差異(P＞0.10)。由此得出，600、800和1 000μmol/L組的細(xì)胞MDA含量較高，其次為100、200和400μmol/L組，對照組最低。

表2 H 2O 2作用濃度對BMEC抗氧化指標(biāo)的影響Table 2 Effects of action concentration of H 2 O2 on antioxdant paramaters of BMECs

3 討論

H2O2是一種重要的ROS，極易穿過細(xì)胞膜，與細(xì)胞內(nèi)Fe2+通過Fenton反應(yīng)形成高活性的自由基(·OH)，導(dǎo)致一系列反應(yīng)，因H2O2容易獲得，性質(zhì)相對穩(wěn)定，操作比較簡單，所以它是目前應(yīng)用最為廣泛的氧化損傷模型的應(yīng)激源，是研究各類細(xì)胞氧化損傷時(shí)使用的主要方法之一［1］。然而，以H2O2為刺激源誘導(dǎo)建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的方法在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域應(yīng)用較多，如體外培養(yǎng)的心肌細(xì)胞及肝臟細(xì)胞，關(guān)于建立BMEC的氧化應(yīng)激損傷模型的研究報(bào)道極少。而且，以H2O2為應(yīng)激源構(gòu)建細(xì)胞氧化損傷模型的報(bào)道中，判斷氧化應(yīng)激是否發(fā)生所選擇的判別指標(biāo)與判別標(biāo)準(zhǔn)不同。一些研究認(rèn)為，MTT法具有特異性強(qiáng)、重復(fù)性好、快速、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)，通過測定其吸光度值的大小即可反映出細(xì)胞數(shù)量的多少，也可反映出細(xì)胞增殖的快慢，進(jìn)而可以作為建立氧化應(yīng)激模型的判別指標(biāo)［8－9］，但目前選擇的判別標(biāo)準(zhǔn)不完全相同。Huo等［10］報(bào)道在小鼠的心肌細(xì)胞中，選取細(xì)胞存活率為40%～50%作為H2O2氧化損傷模型的依據(jù)。Wei等［11］研究表明，以H2O2氧化誘導(dǎo)鼠嗜鉻細(xì)胞瘤，以細(xì)胞死亡率為25%作為建立氧化損傷模型時(shí)選擇H2O2適宜濃度的判別標(biāo)準(zhǔn)。孫婧陶等［12］指出，以細(xì)胞死亡率為50%～60%作為建立延邊奶山羊BMEC氧化損傷模型的判別標(biāo)準(zhǔn)。周麗娜［13］的研究指出，細(xì)胞死亡率為20%～30%可以作為建立小鼠脊髓神經(jīng)元細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的評判標(biāo)準(zhǔn)。由此可見，可能是由于細(xì)胞的種類不同，對氧化損傷的耐受能力不同，因此選擇的細(xì)胞存活率判別標(biāo)準(zhǔn)不同，所報(bào)道的H2O2作用濃度與作用時(shí)間的差別也較大。通常，在建立氧化應(yīng)激模型時(shí)，細(xì)胞的存活率都不宜過高或過低，若存活率過低，說明大量的細(xì)胞已經(jīng)死亡，會造成細(xì)胞不可恢復(fù)的損傷，不利于抗氧化機(jī)制的研究;若存活率過高，說明細(xì)胞是處于相對長勢比較好的狀態(tài)，細(xì)胞的活力也較好，氧化后不會造成明顯的損傷，也不利于后續(xù)試驗(yàn)的開展［14］。由此說明，建立細(xì)胞氧化損傷模型時(shí)需要使細(xì)胞達(dá)到適宜的損傷程度。

此外，氧化應(yīng)激指標(biāo)的變化是判斷細(xì)胞是否發(fā)生了氧化應(yīng)激、是否可建立細(xì)胞氧化應(yīng)激模型的主要依據(jù)，是建立細(xì)胞氧化應(yīng)激損傷模型的關(guān)鍵。除了細(xì)胞存活率外，GPx、SOD和CAT活性以及MDA含量可反映出機(jī)體清除自由基的能力以及脂質(zhì)過氧化損傷的程度，因此，也可以作為判斷細(xì)胞是否發(fā)生氧化應(yīng)激的指標(biāo)［15－16］。楊家軍等［17］研究了斷奶對仔豬腸上皮細(xì)胞的氧化損傷的影響，以SOD、CAT和GPx等酶的活性和MDA的含量作為反映機(jī)體氧化損傷的指標(biāo)，結(jié)果表明，在21日齡時(shí)，與哺乳組仔豬相比，斷奶組仔豬的腸上皮細(xì)胞中SOD、CAT和GPx等抗氧化酶的活性顯著降低，過氧化產(chǎn)物MDA含量顯著升高，其腸上皮細(xì)胞也發(fā)生了明顯的損傷。李永義［18］研究了體外仔豬淋巴細(xì)胞氧化模型的建立，發(fā)現(xiàn)添加200～800μmol/L H2O2后，GPx、SOD 活性顯著降低，MDA含量顯著升高，400μmol/L H2O2可對體外仔豬的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激。韓飛等［6］研究表明，100和1 000μmol/L H2O2能夠顯著降低HepG2中SOD、CAT活性，提高M(jìn)DA含量，而100μmol/L H2O2的對于SOD、CAT活性及MDA含量無顯著的影響，選擇100μmol/L H2O2構(gòu)建了氧化應(yīng)激模型。然而，齊曉龍等［14］用 0.5～8.0 mmol/L的H2O2誘導(dǎo)產(chǎn)蛋雞的原代肝細(xì)胞后，MDA含量隨著H2O2作用濃度的增加而增加，SOD和CAT的活性呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢，最終選擇4 mmol/L的H2O2作為構(gòu)建應(yīng)激模型的濃度。Wijeratne 等［19］研究表明，用 50、100、150、200和250μmol/L H2O2誘導(dǎo)人的病態(tài)的結(jié)腸細(xì)胞后發(fā)現(xiàn)，SOD活性在50μmol/L H2O2作用時(shí)達(dá)到最高，CAT活性在50～250μmol/L作用時(shí)保持不變，GPx活性隨著H2O2作用濃度的增加而升高。由此可見，不同的細(xì)胞在發(fā)生氧化應(yīng)激刺激后，對抗氧化酶活性的影響規(guī)律是相似的，但最終選擇的H2O2作用濃度與作用時(shí)間不完全相同，這可能與細(xì)胞的種類、研究目的不同有很大的關(guān)系。

在此基礎(chǔ)上，試驗(yàn)二又以抗氧化指標(biāo)GPx、SOD、CAT活性和MDA含量為判別依據(jù)，以H2O2的作用時(shí)間為6 h，進(jìn)一步研究了不同濃度的H2O2對細(xì)胞抗氧化酶活性的影響，以進(jìn)一步確定建立細(xì)胞氧化損傷模型時(shí)適宜的H2O2作用濃度。結(jié)果顯示，600～1 000μmol/L組與對照組相比均顯著降低了GPx、SOD和CAT活性，提高了MDA含量，與400μmol/L組比較差異顯著，但 600、800和1 000μmol/L組之間差異不顯著。由此可見，600μmol/L H2O2即可對BMEC產(chǎn)生明顯的氧化應(yīng)激，可以作為建立氧化損傷模型時(shí)的作用濃度，作用濃度再繼續(xù)增加，相關(guān)指標(biāo)的組間無顯著差異。H2O2引起細(xì)胞產(chǎn)生氧化損傷的原因是氧自由基和H2O2會啟動脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的發(fā)生，進(jìn)而產(chǎn)生更多的自由基，隨著氧化和抗氧化過程的不斷進(jìn)行，造成機(jī)體抗氧化能力的耗竭，導(dǎo)致氧化和抗氧化的嚴(yán)重不平衡［21］，從而造成了機(jī)體的氧化損傷，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生的大量的自由基破壞了生物膜影響了酶的活性，加速蛋白質(zhì)的分解，進(jìn)而影響抗氧化酶的活力、導(dǎo)致抗氧化能力的降低［22］。還有研究指出，機(jī)體內(nèi)抗氧化酶活力的降低是終產(chǎn)物H2O2的反饋?zhàn)饔没虺蹶庪x子(·O－2)使其滅活，這被認(rèn)為是機(jī)體自身在環(huán)境因素下的保護(hù)效應(yīng)［23］。因此，綜合本試驗(yàn)的細(xì)胞存活率和抗氧化指標(biāo)結(jié)果得出，以H2O2為應(yīng)激源，其作用濃度為600μmol/L、作用時(shí)間為6 h可以引起B(yǎng)MEC的氧化損傷，可以作為建立BMEC氧化損傷模型的適宜條件。

4 結(jié)論

① 細(xì)胞存活率和抗氧化指標(biāo)(GPx、SOD和CAT活性及MDA含量)可以作為判別BMEC是否發(fā)生氧化應(yīng)激的指標(biāo)。

② 600μmol/L H2O2作用BMEC 6 h，可以作為建立BMEC氧化損傷模型的適宜條件。

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