苦參堿對人鼻咽癌CNE2細胞裸鼠移植瘤生長及凋亡相關基因表達的影響*

何光耀，謝 貌，唐安洲，譚頌華

廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 南寧530021

#通訊作者，男，1962年3月生，教授，研究方向:抗鼻咽癌中藥研究，E-mail:anzhoutang@126.com

鼻咽癌是我國南方地區(qū)常見的頭頸部惡性腫瘤之一，其主要的治療方式是以放療為主、化療為輔的綜合治療，但放化療具有明顯的副作用，為此需要找尋一種更安全有效的治療方式［1］?？鄥A(matrine)是從中藥苦參中提取的一種生物堿類活性成分，具有抗心律失常、抗炎、抗纖維化、抗腫瘤等多方面藥理活性，可抑制多種腫瘤細胞的生長并誘導其凋亡［2］。該實驗主要通過觀察苦參堿對人鼻咽癌CNE2 細胞裸鼠移植瘤生長及其凋亡相關基因表達的影響，初步探討苦參堿抗腫瘤作用的機制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器 苦參堿(純度≥98%)購于陜西昂盛生物醫(yī)藥科技有限公司，用培養(yǎng)液配制成相應濃度溶液，過濾除菌，4℃保存。Trizol 購于Invitrogen 公司，逆轉錄試劑盒購于Fermentas 公司，二甲基亞砜(DMSO)、MTT、RIPA 裂解液、苯甲基磺酰氟(PMSF)、EDTA 胰蛋白酶及BCA 蛋白濃度測量試劑盒購于上海碧云天公司。胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基及青霉素、鏈霉素均購于美國Hyclone 公司。培養(yǎng)箱為美國Thermo 公司產品。倒置顯微鏡為日本Olympus 公司產品。PCR 儀為美國ABI 公司產品。SCV4A1 型超凈工作臺購于新加坡ESCO 公司。

1.2 裸鼠移植瘤模型的制備 人鼻咽癌CNE2 細胞株由廣西醫(yī)科大學實驗中心鼻咽癌實驗室傳代培養(yǎng)，接種于含100 U/mL 青霉素、鏈霉素及體積分數10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，于37℃、體積分數5%CO2、飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，用胰蛋白酶消化傳代。于裸鼠右前腋皮下接種胎牛血清重懸的CNE2 細胞懸液0.2 mL(約1×107mL－1)，制備裸鼠移植瘤模型，以瘤體直徑達到5 mm 且質硬為成瘤。

1.3 實驗分組 20 只BALB/C 裸鼠由廣西醫(yī)科大學動物實驗中心提供，鼠齡4～6 周，體重(20±2)g，雌雄不拘，按1.2 方法制備裸鼠移植瘤模型。成瘤后，隨機分成苦參堿高劑量組、苦參堿低劑量組、陽性對照組及陰性對照組，每組5 只。藥物用無菌生理鹽水溶解?？鄥A高、低劑量組分別腹腔注射100、50 mg/kg 苦參堿，陽性對照組腹腔注射順鉑2 mg/kg，陰性對照組給予生理鹽水10 mL/kg。隔日給藥1 次，共給藥7 次。

1.4 抑瘤率的測定 給藥14 d 后，頸椎脫臼處死裸鼠，剖出瘤體，測量瘤重，計算抑瘤率。抑瘤率=(1 － 給藥組平均瘤重/陰性對照組平均瘤重)×100%。

1.5 移植瘤組織中bax、bcl-2、caspase-3 mRNA 的檢測 按照Trizol 試劑說明提取移植瘤組織總RNA，按逆轉錄試劑盒說明進行逆轉后，以GAPDH為內參，進行PCR。GAPDH 上游引物序列為5'-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3'，下游引物序列為5'-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3';bax 上游引物序列為5'-ATGGACGGGTCCGGGGAGCA-3'，下游引物序列為5'-TGCTCGATCCTGGATGAAACCCT-3';bcl-2 上游引物序列為5'-TCGCCCTGTGGATGACTGAG-3'，下游引物序列為5'-CAGAGTCTTCAGAGACAGC CAGGA-3';caspase-3 上游引物序列為 5'-TG CATACTCCACAGCACCTGGTTA-3' 下游引物序列為5'-CATGGCACAAAGCGACTGGATGAA-3'。PCR 反應體系20 μL，包括10× PCR buffer 2 μL，MgCl2buffer(25 mmol/L)1.6 μL，dNTPs(10 mmol/L)2 μL，Taq 酶(5 U/μL)0.1 μL，ddH2O 11.3 μL，cDNA 1 μL，上、下游引物各1 μL。PCR 反應條件:95℃預變性3 min;94℃30 s，56～60℃退火30 s，72℃30 s，循環(huán)30 次;72℃延伸5 min。產物經20 g/L瓊脂糖凝膠電泳成像，采用Image pro plus 6.0 圖像軟件分析，目的基因mRNA 的相對表達量=目的基因條帶吸光度/GAPDH 條帶吸光度。

1.6 移植瘤組織中bax、bcl-2、caspase-3 蛋白的檢測 瘤體經過勻漿機處理后離心，棄上清，加入含有10 μL PMSF 的RIPA 裂解液1 000 μL，冰上裂解細胞30 min，4℃12 000 g 離心15 min，收集細胞總蛋白，BCA 法測蛋白濃度。取蛋白，經SDS-PAGE 凝膠電泳分離，切膠，轉至PVDF 膜上，用50 g/L 脫脂牛奶室溫封閉2 h，用抗兔bax、bcl-2、caspase-3 抗體(稀釋1 000 倍)及HRP 標記的GAPDH(稀釋10 000倍)4℃孵育過夜，TBST 洗膜5 min×3 次，HRP 標記山羊抗兔IgG(稀釋1 000 倍)室溫孵育2 h，TBST 洗滌5 min×3 次，ECL 顯影，壓片，在凝膠成像儀上成像，用Image pro plus 6.0 分析圖像，目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶吸光度/GAPDH 條帶吸光度。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 16.0 處理數據。4組抑瘤率、瘤組織中相應蛋白和mRNA 表達水平的比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t 檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 4組抑瘤率的比較 20 只裸鼠均達到成瘤標準。給藥14 d 后，陽性對照組和苦參堿低、高劑量組抑瘤率分別為51.6%、26.4%和43.2%。

2.2 4組移植瘤組織中bax、bcl-2、caspase-3 mRNA 表達的比較 見表1。

表1 4組移植瘤組織中bax、bcl-2 和caspase-3 mRNA 相對表達量的比較

2.3 移植瘤組織中bax、bcl-2、caspase-3 蛋白的表達 見圖1、表2。

圖1 4組移植瘤組織中bax、bcl-2、caspase-3 蛋白的表達

3 討論

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及消退與細胞凋亡異常有著密切的關系，而大多數的抗腫瘤藥物均能誘導腫瘤細胞凋亡［3］。半胱天冬氨酸酶caspase 和bcl-2 基因家族在細胞凋亡過程中發(fā)揮著重要作用。Caspase作為細胞凋亡的核心，參與啟動和執(zhí)行細胞凋亡，其中caspase-3 是細胞凋亡的執(zhí)行者。細胞接受凋亡信號后，caspase 系統(tǒng)激活，啟動caspase 級聯(lián)反應，活化caspase-3，執(zhí)行凋亡。bcl-2 和bax 均是bcl-2家族重要成員，bax 能與bcl-2 結合形成二聚體，抑制或者促進細胞凋亡。bax 表達增高、bcl-2 表達減少能活化caspase-3，從而促進細胞凋亡;而bcl-2 表達增高、bax 表達減少則抑制caspase-3 活化，細胞凋亡也相應受抑制［4-5］。

苦參堿是一種生物活性堿，其毒副作用低，生物活性高，可以體外抑制神經母細胞癌、卵巢癌、白血病、腎癌、鼻咽癌等細胞的生長［6-10］。該研究中，作者建立了裸鼠CNE2 移植瘤模型，觀察了苦參堿對移植瘤生長及凋亡相關基因表達的影響。

有資料顯示，苦參堿可以抑制胃癌細胞SGC-7901 的增殖，通過升高caspase-3 表達誘導癌細胞凋亡［11］;也可以降低白血病細胞HL-60、U937 的bcl-2/bax 比值，增加p-Akt、p-Erk 的表達，誘導凋亡［3］。研究［12］已經發(fā)現(xiàn)0.1 g/L 的苦參堿可導致白血病細胞K562 體積變小、核固縮、碎裂，細胞內膜的結構也呈凋亡早期改變。該研究中作者發(fā)現(xiàn)，苦參堿能明顯抑制移植瘤的生長;同時，苦參堿可以上調移植瘤組織中bax 和caspase-3 mRNA 和蛋白的表達，下調bcl-2 mRNA 和蛋白的表達，說明苦參堿能明顯改變鼻咽癌CNE2 細胞裸鼠移植瘤組織中凋亡相關基因的表達。推測苦參堿可能是通過誘導凋亡抑制鼻咽癌裸鼠移植瘤的生長，發(fā)揮體內抗腫瘤作用。

總之，苦參堿的抗腫瘤作用與誘導凋亡有關。但苦參堿是如何通過具體通路發(fā)揮抑瘤作用尚未明確，是否與MAPK、PI3K-AKT 等細胞信號轉導通路有關［13］，還需進一步的實驗證實。

［1］Agulnik M，Epstein JB.Nasopharyngeal carcinoma:current management，future directions and dental implications［J］.Oral Oncol，2008，44(7):617

［2］肖碩.苦參堿多種抗癌功效研究進展［J］.實用醫(yī)學雜志，2010，26(24):4605

［3］Plati J，Bucur O，Khosravi-Far R.Apoptotic cell signaling in cancer progression and therapy［J］.Integra Biol(Camb)，2011，3(4):279

［4］Thornberry NA，Lazebnik Y.Caspases:enemies within［J］.Science，1998，281(5381):1312

［5］Cory S，Adams JM.Killing cancer cells by flipping the Bcl-2/Bax switch［J］.Cancer Cell，2005，8(1):5

［6］Zhang S，Zhang Y，Zhuang Y，et al.Matrine induces apoptosis in human acute myeloid leukemia cells via the mitochondrial pathway and Akt inactivation［J］.PloS One，2012，7(10):e46853

［7］黃宇賢，王楊，孫明，等.苦參堿通過誘導NKG2D 配體高表達增強NK 細胞對ABCG2high 耐藥鼻咽癌細胞殺傷活性［J］.南方醫(yī)科大學學報，2009，29(7):1329

［8］羅娟，許偉，薛天陽，等.苦參堿對人神經母細胞瘤SHSY5Y 細胞的作用機制［J］.實用兒科臨床雜志，2012，27(3):190

［9］種鐵，付德來，牛建強，等.苦參堿對體外培養(yǎng)的人ACHN 腎癌細胞的生長抑制作用及其機制［J］.西安交通大學學報:醫(yī)學版，2010，31(6):740

［10］李瑞萍，胡雪梅，呂銀鳳，等.苦參堿對人卵巢癌細胞增殖的影響及其機制［J］.西安交通大學學報:醫(yī)學版，2010，31(5):622

［11］Dai ZJ，Gao J，Ji ZZ，et al.Matrine induces apoptosis in gastric carcinoma cells via alteration of Fas/FasL and activation of caspase-3［J］.J Ethnopharmacol，2009，123(1):91

［12］張翠梅，高建慧，李德樂，等.苦參堿誘導K562 細胞向紅系分化伴隨凋亡［J］.南方醫(yī)科大學學報，2008，28(3):478

［13］Tulalamba W，Janvilisri T.Nasopharyngeal carcinoma signaling pathway:an update on molecular biomarkers［J］.Int J Cell Biol，2012，2012:594681