西妥昔單抗聯(lián)合奈達(dá)鉑對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響*

鄧克紅，王晨陽，王武亮

鄭州大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科 鄭州450014

#通訊作者，男，1963年11月生，本科，主任醫(yī)師，研究方向:婦科腫瘤，E-mail:wangwuliang888@sina.com

宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一。近20年來，發(fā)病率呈現(xiàn)年輕化特點(diǎn)。由于傳統(tǒng)手術(shù)和放療對(duì)患者生活質(zhì)量的影響不可逆，所以宮頸癌化療受到了越來越多的關(guān)注［1］。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)在很多實(shí)體瘤包括宮頸癌中都有過量表達(dá)［2］，與腫瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)特征和預(yù)后密切相關(guān)［3］。EGFR 抑制劑已成為靶向治療的熱點(diǎn)。西妥昔單抗(cetuximab，C225)是常見的特異性EGFR 抑制劑，臨床上已經(jīng)用于晚期頭頸部鱗癌和直腸癌的治療，并取得了滿意的療效。奈達(dá)鉑(nedaplatin，NDP)屬第二代有機(jī)鉑類，其劑量限制毒性是血小板減少，部分患者因發(fā)生嚴(yán)重的血小板下降而導(dǎo)致化療停止［4］;臨床上已試圖尋找NDP 增敏藥物或聯(lián)合用藥以增強(qiáng)其療效，降低其毒副作用。有臨床研究［5］提出EGFR 特異性抑制劑C225 可增敏化療藥物的細(xì)胞殺傷作用，但C225與NDP 聯(lián)用的療效國內(nèi)尚未見報(bào)道。該實(shí)驗(yàn)旨在探討C225、NDP 單用及兩藥聯(lián)合應(yīng)用對(duì)人宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖作用的影響，為C225 在宮頸癌中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及主要試劑 Hela 細(xì)胞株(購自鄭州創(chuàng)生生物工程有限公司)用含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)液在37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2.5 g/L 胰蛋白酶原消化傳代。C225 購自長沙市康來醫(yī)藥公司，NDP 購自江蘇奧賽康藥業(yè)有限公司。

1.2 C225 對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用 取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞密度調(diào)至(4～5)×106mL－1。按每孔100 μL 接種在96 孔板上，置于37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，細(xì)胞全部貼壁后，棄去孔內(nèi)的培養(yǎng)液，依實(shí)驗(yàn)分組加入100 μL 不同質(zhì)量濃度(10、20、40、60、80 和160 mg/L)的C225 和100 μL RPMI 1640，總體積200 μL。每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)5 個(gè)復(fù)孔(陰性對(duì)照為單細(xì)胞懸液)。繼續(xù)分別培養(yǎng)24、48 和72 h。在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)每孔加入20 μL MTT 繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄去上清液后每孔加入200 μL二甲基亞砜(DMSO)，置于搖床上低速振蕩10 min。在自動(dòng)酶標(biāo)讀數(shù)儀上選擇波長490 nm，空白組調(diào)零，測(cè)各孔的OD 值，并計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次。計(jì)算公式為:細(xì)胞增殖抑制率=(1 －實(shí)驗(yàn)組平均OD 值/對(duì)照平均OD 值)×100%。

1.3 NDP 對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用 按1.2的方法培養(yǎng)細(xì)胞，用不同質(zhì)量濃度(1、5、10、20、40和60 mg/L)NDP 分別培養(yǎng)24、48 和72 h，用MTT法測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。

1.4 40 mg/L C225 聯(lián)合不同質(zhì)量濃度NDP 對(duì)Hela 細(xì)胞增殖的抑制作用 按1.2 的方法培養(yǎng)細(xì)胞。將C225 質(zhì)量濃度定為40 mg/L，分別與奈達(dá)鉑(1、5、10、20、40 和60 mg/L)聯(lián)合處理細(xì)胞，設(shè)空白組、對(duì)照組，每組分別培養(yǎng)24、48 和72 h 后用MTT法測(cè)細(xì)胞增殖抑制率。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0 進(jìn)行分析，應(yīng)用6×3 析因設(shè)計(jì)的方差分析比較C225、NDP 單藥及聯(lián)合用藥不同質(zhì)量濃度及不同時(shí)間對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞抑制作用的差異，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 C225 單藥對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖抑制作用 見表1。由表1可以看出，隨著C225 質(zhì)量濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞增殖抑制率的變化差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 C225 對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖抑制率(n=5)%

2.2 NDP 單藥對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖抑制作用 見表2。由表2可以看出，隨著NDP 質(zhì)量濃度的增加和作用時(shí)間的延長，細(xì)胞的增殖抑制率逐漸增加。

表2 NDP 單藥對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖抑制率(n=5)%

2.3 C225 聯(lián)合NDP 對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖抑制作用 由于各質(zhì)量濃度的C225 對(duì)Hela 細(xì)胞增殖抑制作用差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，故根據(jù)臨床經(jīng)驗(yàn)選擇質(zhì)量濃度為40 mg/L C225 聯(lián)合不同質(zhì)量濃度NDP作用于Hela 細(xì)胞，24、48 和72 h 后的細(xì)胞增殖抑制率見表3。從表3可以看出，C225 聯(lián)合NDP 用藥對(duì)細(xì)胞增殖的抑制率明顯高于對(duì)應(yīng)的C225 或NDP單藥。

表3 40 mg/L C225 聯(lián)合不同質(zhì)量濃度NDP 對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞的增殖抑制率(n=5)%

3 討論

EGFR 廣泛地存在于正常人體的細(xì)胞表面，配體與其結(jié)合后調(diào)控細(xì)胞的生理過程，在正常細(xì)胞的生長、增殖、分化及凋亡過程中發(fā)揮著重要的功能。EGFR 基因的突變和EGFR 的異常高表達(dá)可以在多種實(shí)體惡性腫瘤中檢測(cè)到［2］，如宮頸癌、卵巢癌、直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤等。EGFR 蛋白的異常高表達(dá)促使腫瘤細(xì)胞活化，長期處于無限增殖狀態(tài)，是腫瘤形成的重要原因之一［6］。有研究者［4］提出，EGFR 在宮頸癌中陽性表達(dá)者占60%～90%，且EGFR 的高表達(dá)與宮頸癌的復(fù)發(fā)及預(yù)后密切相關(guān)。并且EGFR 蛋白的異常高表達(dá)可增加腫瘤細(xì)胞粘附于細(xì)胞外基質(zhì)，增加腫瘤細(xì)胞降解基底膜、血管形成及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的機(jī)會(huì)［7］。特異性的EGFR 靶向藥物目前主要有兩種:一種是小分子酪氨酸激酶(EGFR-TK)抑制劑，可促進(jìn)凋亡［8］，代表藥物是易瑞沙;另一種是單克隆抗體，主要作用于EGFR 位于細(xì)胞外的配體結(jié)合區(qū)，競(jìng)爭性地抑制受體與配體的結(jié)合，阻斷受體激活途徑，代表藥物是C225。臨床上，C225 已經(jīng)用于某些腫瘤如直腸癌、頭頸部腫瘤等的治療，并且取得了較好的療效。但關(guān)于C225 對(duì)宮頸癌的療效，國內(nèi)外研究較少。作者通過體外實(shí)驗(yàn)研究顯示C225 單藥對(duì)宮頸癌Hela 細(xì)胞增殖無明顯抑制作用?？赡茉蚴荂225 的主要抗癌機(jī)制并不是直接作用于腫瘤細(xì)胞，由于腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞與細(xì)胞間存在復(fù)雜的細(xì)胞應(yīng)答反應(yīng)，體外細(xì)胞培養(yǎng)缺少細(xì)胞間的相互作用和影響，C225 可能通過直接或間接影響腫瘤細(xì)胞血管生成、細(xì)胞粘附及增殖能力而發(fā)揮抗腫瘤作用。

臨床上，NDP 對(duì)宮頸癌、頭頸癌、非小細(xì)胞肺癌、食管癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤有效。NDP 與順鉑相比，胃腸道反應(yīng)輕，腎毒性和神經(jīng)毒性小，患者的總生存率與順鉑相同，但有提高趨勢(shì)［4］。Koshiyama 等［9］提出，在臨床前研究中，與順鉑的抗腫瘤活性相比，NDP 更好。但NDP 的劑量限制毒性是骨髓抑制導(dǎo)致的血小板減少，部分患者發(fā)生嚴(yán)重的血小板下降導(dǎo)致化療停止［4］。該實(shí)驗(yàn)研究顯示，NDP 對(duì)Hela 的增殖抑制作用呈現(xiàn)明顯的質(zhì)量濃度和時(shí)間依賴，與文獻(xiàn)［10］報(bào)道基本一致。

有研究報(bào)道靶向藥物和化療藥物因不同的抗腫瘤作用機(jī)制，故沒有重復(fù)交叉細(xì)胞毒作用，還可在增加彼此療效的同時(shí)降低各自用藥劑量，并降低了對(duì)正常細(xì)胞的毒副作用。研究［11］表明，C225 與化療藥物聯(lián)合應(yīng)用療效要優(yōu)于單純化療。該研究結(jié)果顯示C225 聯(lián)合NDP 后，細(xì)胞增殖抑制率明顯增加，明顯高于C225 單藥或NDP 單藥，且呈現(xiàn)質(zhì)量濃度和時(shí)間依賴，說明C225 能增敏Hela 細(xì)胞對(duì)NDP 的反應(yīng)。當(dāng)NDP 的質(zhì)量濃度較低時(shí)，C225 增敏作用較明顯，隨著NDP 質(zhì)量濃度逐漸增加，聯(lián)合用藥時(shí)細(xì)胞增殖抑制率增幅較濃度低時(shí)減弱。該研究屬體外實(shí)驗(yàn)，還缺乏生物體內(nèi)復(fù)制的細(xì)胞與細(xì)胞間反應(yīng)和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究，需要體內(nèi)試驗(yàn)進(jìn)一步深入探索。

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