胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)外周血MicroRNA分子標(biāo)記物的臨床價(jià)值＊

鄭君華，王永兵，顧天來，羅蕓葆（上海市浦東新區(qū)人民醫(yī)院普外科 201200）

>中國(guó)是胃癌高發(fā)區(qū)，特別是在農(nóng)村地區(qū)，胃癌的總發(fā)病率在各類惡性腫瘤中居首位［1］。早期胃癌患者多無特異性癥狀，約三分之二的患者在確診時(shí)便處于中晚期或出現(xiàn)轉(zhuǎn)移［2］。影像學(xué)檢查在微小病灶方面有一定的局限性［3］。而腫瘤標(biāo)記物如癌胚抗原、糖鏈抗原（CA）72-4和CA19-9的異常一般在晚期胃癌患者中才能檢出，且其陽(yáng)性率不到50%［4］。MicroRNA（miRNA）在組織和細(xì)胞中的表達(dá)與腫瘤呈現(xiàn)顯著的相關(guān)性、組織特異性和表達(dá)穩(wěn)定性，并且在外周血中的表達(dá)與腫瘤中的表達(dá)具有一定的一致性［5］。目前已經(jīng)證實(shí)，有5種血清miRNA（miR-1，miR-20a，miR-27a，miR-34和miR-423-5p）是胃癌的診斷標(biāo)志物，且其表達(dá)水平與腫瘤的分期相關(guān)［6］。本研究選擇hsa-miR-106a進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶聯(lián)反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)，評(píng)估hsa-miR-106a作為外周血中與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)的分子標(biāo)志物，用于臨床胃癌篩查的應(yīng)用前景。現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取2010年5月至2012年12月本院普外科住院、術(shù)前行胃鏡及病理檢查確診并行根治性手術(shù)治療的80例胃癌患者為研究對(duì)象，其中男52例，女28例；年齡31～82歲，平均年齡（53.6±8.3）歲。將胃癌患者按照淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目分為N0組（無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移）46例，其中男31例，女15例，平均年齡（56.0±13.2）歲；N3組（淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移大于7枚）34例，其中男21例，女13例，平均年齡（52.6±15.5）歲。并選取同一時(shí)期的體檢健康者40例為健康對(duì)照組，其中男25例，女15例，平均年齡（47.2±11.2）歲。并做miRNA芯片檢測(cè)。3組一般資料比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 外周血miRNA的抽提及檢測(cè) 分別采集研究對(duì)象3 mL全血，置乙二胺四乙酸鹽（EDTA）抗凝管中，常溫下1 500 r／min離心15min。將上層血漿（約1.5mL）轉(zhuǎn)移到1.5mL無RNA酶的EP管中，-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。按照說明書步驟，用Ambion公司的mirVana miRNA Isolation Kit抽提外周血miRNA，并檢測(cè)miRNA的質(zhì)量。按照說明書上的步驟，采用FlashTag Biotin RNA Labeling Kit進(jìn)行樣品標(biāo)記，再采用GeneChip miRNA 2.0進(jìn)行miRNA檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)由博奧生物有限公司完成。

1.2.2 qRT-PCR檢測(cè) 檢測(cè)對(duì)象包括N0組46例、N3組34例，健康對(duì)照組40例。應(yīng)用miRNA qRT-PCR引物試劑盒（美國(guó)AB公司）PCR擴(kuò)增。先逆轉(zhuǎn)錄成熟的miRNA，反應(yīng)結(jié)束后，將逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10倍稀釋進(jìn)行PCR反應(yīng)。PCR體系為：TaqMan MicroRNA Assay 20×1.0μL，Product from RT reaction（Minimum 1∶10Dilution）2.0μL，TaqMan 2×Universal PCR Master Mix 10μL，Nuclease free water 7μL，總共20μL。95℃預(yù)變性10s；95℃變性5s，60℃退火延伸20s，重復(fù)40個(gè)循環(huán)，70～95℃繪制融解曲線結(jié)果分析以U6snRNA為內(nèi)參，通過2-ΔΔCT法計(jì)算不同組之間hsa-miR-106a的表達(dá)差異。其中，ΔCt=Ct miRNA-CtU6，ΔΔCt=ΔCtM-ΔCt NM。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 使用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量及計(jì)數(shù)資料分別采用±s或百分率表示，組間比較采用獨(dú)立樣本的t檢驗(yàn)或χ2檢驗(yàn)，以α=0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 miRNA芯片檢測(cè)結(jié)果在N3、N0組胃癌患者中均明顯上調(diào)的miRNA包括hsa-miR-16、hsa-miR-190、hsa-miR-101、hsa-miR-122、hsa-miR-149、hsa-miR-1、hsa-miR-20a；在N3、N0組胃癌患者中均明顯下調(diào)的miRNA包括hsa-miR-148a、hsamiRPlus-C1110、hsa-miR-423-5p、hsa-miR-7、hsa-miR-877、hsamiR-185、hsa-miR-365；在N3組患者表達(dá)上調(diào)最為明顯而在N0組患者中無明顯變化的miRNA包括hsa-miRNA-218、hsamiR-106a、hsa-miR-103a、hsa-miR-130b、hsa-miR-141、hsa-miR-203、hsa-miR-222、hsa-miR-29b。其中hsa-miR-106a最符合作為分子標(biāo)記物的條件。具體見表1。

表1 miRNA芯片檢測(cè)N3組與N0組中miRNA表達(dá)情況(±s）

表1 miRNA芯片檢測(cè)N3組與N0組中miRNA表達(dá)情況(±s）

?

續(xù)表1 miRNA芯片分析N3組與N0組中miRNA表達(dá)情況(±s）

續(xù)表1 miRNA芯片分析N3組與N0組中miRNA表達(dá)情況(±s）

?

2.2 hsa-miR-106aqRT-PCR結(jié)果46例N0組胃癌患者、34例N3組胃癌患者及40例健康者外周血中hsa-miR-106a的表達(dá)情況分別見圖1、圖2、圖3。N0組外周血hsa-miR-106a表達(dá)水平均值為（0.990±5.576），N3組外周血hsa-miR-106a均值為（-9.698±6.485），健康對(duì)照組均值為（-0.279±6.041）。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，N3組的外周血hsa-miR-106a的表達(dá)水平與N0組及健康對(duì)照組比較顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但N0組與健康對(duì)照組之間外周血hsa-miR-106a的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見圖4。

圖1 N0組外周血中hsa-miR-106a的表達(dá)水平

圖2 N3組外周血中hsa-miR-106a的表達(dá)水平

圖3 健康對(duì)照組外周血中hsa-miR-106a的表達(dá)水平

圖4 各組hsa-miR-106a表達(dá)水平比較

2.3 胃癌患者外周血hsa-miR-106a的表達(dá)與臨床病理參數(shù)的關(guān)系hsa-miR-106a的表達(dá)水平除了與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)外（P＜0.05），與患者性別、年齡、腫瘤大小、部位、組織學(xué)類型、腫瘤類型及分化程度等均無關(guān)（P＞0.05）。

3 討 論

在不同腫瘤疾病中，miRNA具有特定的表達(dá)模式，這些特點(diǎn)在肝癌、肺癌、腸癌、卵巢癌和白血病等多種惡性腫瘤中得到了證實(shí)［7］，也使miRNA成為腫瘤診斷的新生物學(xué)標(biāo)記和治療靶標(biāo)。外周血miRNA在胃癌中的檢測(cè)已有一些研究。例如通過生物芯片分析技術(shù)比較胃腫瘤組織miRNA和血漿miRNA，對(duì)hsa-miR-17-5p、hsa-miR-21、hsa-miR-106a、miR-106b和let-7a等外周血miRNA進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)血漿中miRNA的表達(dá)水平與大部分腫瘤組織miRNA的表達(dá)水平一致［8］。采用常規(guī)RNA提取方法便可以從血清中獲得滿足實(shí)驗(yàn)需要的miRNA，這也為外周血miRNA的臨床檢測(cè)奠定了基礎(chǔ)。

本研究應(yīng)用最新版本的miRNA生物芯片，篩選出幾種具有較高差異表達(dá)水平的外周血miRNA胃癌標(biāo)記物。這些miRNA在N3組表達(dá)上調(diào)，而在N0組基本不變，其中hsamiR-106a最符合作為分子標(biāo)記物的條件。hsa-miR-106a定位于X染色體上，通常表達(dá)于由內(nèi)胚層分化而來的組織干細(xì)胞中。通過序列搜索，已證實(shí)hsa-miR-106a潛在的目的基因超過700種，所表達(dá)的蛋白包括細(xì)胞周期調(diào)控蛋白、細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白、血管生成相關(guān)蛋白、腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)蛋白等。在乳腺癌轉(zhuǎn)移研究中，發(fā)現(xiàn)層粘連蛋白5是基底膜的重要組成成分，而基底膜介導(dǎo)上皮細(xì)胞間的粘連。當(dāng)層粘連蛋白5表達(dá)增加時(shí)，癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移減少。hsa-miR-106a的過表達(dá)可下調(diào)層粘連蛋白5的表達(dá)，從而刺激癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移［9］。RB可與甲基化轉(zhuǎn)移酶組成復(fù)合物行使甲基轉(zhuǎn)移的功能。而RB和SUV420H1同時(shí)受hsa-miR-106a的負(fù)調(diào)控，在hsa-miR-106a的作用下表達(dá)降低，從而促進(jìn)基因的低甲基化［10］。因此，本研究以hsa-miR-106a為研究對(duì)象，擴(kuò)大標(biāo)本量，通過qRT-PCR進(jìn)行進(jìn)一步的研究。經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析，N3組的外周血hsa-miR-106a表達(dá)水平與N0組及健康對(duì)照組比較顯著上調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），但N0組與健康對(duì)照組之間外周血hsa-miR-106a的表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。這與Xiao等［11］研究中發(fā)現(xiàn)淋巴及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的胃癌組織中hsa-miR-106a高表達(dá)相符。

胃癌的發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜，可能的病因包括幽門螺旋桿菌感染、環(huán)境因素以及遺傳因素等［12］。傳統(tǒng)的胃癌腫瘤標(biāo)記物在特異性與敏感性的兼容性方面都不是特別理想。相比之下miRNA具有高度的保守性、時(shí)序性和組織特異性，PCR檢測(cè)高靈敏度以及特異性引物的使用，使得miRNA兼容腫瘤診斷的特異性和敏感性成為可能。期望通過對(duì)hsa-miRNA-106a以及其他胃癌特異性miRNA的進(jìn)一步研究，能為胃癌的預(yù)防、臨床診斷和治療開辟一條新的道路。

［1］Rifai N，Gillette MA，Carr SA.Protein biomarker discovery and validation：the long and uncertain path to clinical utility［J］.Nat Biotechnol，2006，24（8）：971-983.

［2］Lu J，Getz G，Miska EA，et al.MicroRNA expression profiles classify human cancers［J］.Nature，2005，435（743）：834-838.

［3］Lee YS，Dutta A.MicroRNAs in cancer［J］.Annu Rev Pathol，2009，24（4）：199-277.

［4］樊代明.腫瘤研究前沿［M］.西安：第四軍醫(yī)大學(xué)出版社，2009：160-170.

［5］Alvarez-Garcia I，Miska EA.MicroRNA functions in animal development and human disease［J］.Development，2005，132（21）：4653-4662.

［6］Liu R，Zhang C，Hu Z，et al.A five-microRNA signature identified from genome-wide serum microRNA expression profiling serves as a fingerprint for gastric Cancer diagnosis［J］.Eur J Cancer，2011，47（5）：784-791.

［7］Zhou L，Zhao YP，Liu WJ，et al.Circulating microRNAs in Cancer：diagnostic and prognostic significance［J］.Expert Rev Anticancer Ther，2012，12（2）：283-288.

［8］Bartel DP.MicroRNAs：target recognition and regulatory functions［J］.Cell，2009，136（2）：215-233.

［9］Mccave EJ，Cass CA，Burg KJ，et al.The normal microenvironment directs mammary gland development［J］.J Mammary Gland Biol Neoplasia，2010，15（3）：291-299.

［10］Tryndyak VP，Kovalchuk O，Pogribny IP.Loss of DNA methylation and histone H4lysine 20trimethylation in human breast Cancer cells is associated with aberrant expression of DNA methyltransferase 1，Suv4-20h2histone methyltransferase and methyl-binding proteins［J］.Cancer Biol Ther，2006，5（1）：65-70.

［11］Xiao B，Guo J，Miao Y，et al.Detection of miR-106ain gastric carcinoma and its clinical significance［J］.Clin Chim Acta，2009，400（1／2）：97-102.

［12］James GF，Timothy CW.Inflammation，atrophy and gastric cancer［J］.J Clin Invest，2007，117（2）：60-69.