艱難梭菌毒素B受體結合區(qū)CDB3融合蛋白誘導表達條件優(yōu)化及其純化＊

陳 偉，劉文恩，李艷華，簡子娟，羅 姍，鐘一鳴（中南大學湘雅醫(yī)院檢驗科，長沙 410008）

艱難梭菌是一種革蘭陽性厭氧芽孢桿菌，是院內(nèi)腸道感染的主要致病菌之一［1-2］。近年來，艱難梭菌感染性疾病發(fā)病率，尤其是毒素陽性患者檢出率有所升高，此類患者的病情通常較為嚴重，患者病死率較高［3-7］。目前，可用于艱難梭菌檢測的方法較多，相對常見是酶聯(lián)免疫吸附法進行毒素檢測［8-9］。相關研究報道顯示，艱難梭菌毒素B可單獨致病［10-11］。因此，如果臨床僅單純進行艱難梭菌毒素A的檢測，有可能漏檢部分患者。目前，國內(nèi)外均已出現(xiàn)了多藥耐藥艱難梭菌感染病例［12］，而疫苗免疫是防治艱難梭菌感染的最理想途徑和方法［13-16］。相關研究表明，抗艱難梭菌毒素B受體結合區(qū)CDB3抗體可作為免疫疫苗，保護完整細胞免受毒素B的細胞毒性作用［17］。

本研究前期通過提取艱難梭菌基因組DNA，采用聚合酶鏈反應（PCR）擴增了毒素B受體結合區(qū)CDB3基因片段，成功構建了原核表達載體pGEX-4T-1-CDB3，該載體經(jīng)異丙基-β-D巰基半乳糖苷（IPTG）誘導后可表達融合蛋白，且所表達的融合蛋白經(jīng)Western blot試驗驗證正確［18］。然而，由于制備單克隆抗體需要大量且純化的抗原用于小鼠免疫及雜交瘤細胞篩選。因此，本研究擬通過優(yōu)化融合蛋白誘導表達條件，大量表達融合蛋白，并對其進行純化，為抗艱難梭菌毒素B受體結合區(qū)CDB3單克隆抗體的研制奠定基礎，為艱難梭菌的檢測與疾病的預防提供新方法。

1 材料與方法

1.1 實驗菌株實驗菌株為本實驗室劉元元碩士構建并于-80℃保存的含融合質(zhì)粒pGEX-4T-1-CDB3的大腸埃希菌（E.coli）菌株BL21（DE3），此質(zhì)粒具有氨芐西林（Amp）抗性和谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶（GST）純化標簽［19］。

1.2 儀器與試劑酶標檢測儀（美國BIO-TEK公司）、恒溫搖床（天呈實驗儀器制造有限公司）、-80℃超低溫冰箱（中科美菱公司）、微型雙垂直電泳儀（沃德生物醫(yī)學儀器公司）；十二烷基磺酸鈉（SDS）-聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）凝膠配制試劑盒（上海碧云天有限公司）、IPTG（北京鼎國生物技術有限公司）、Amp（上海生工生物工程有限公司）、SefinoseTMGST親和層析柱（上海生工生物工程有限公司）、抗GST單克隆抗體（德國MERCK公司）、聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（美國Millipore公司）、辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物有限公司）、醫(yī)用X光膠片（美國柯達公司）等。

1.3 方法

1.3.1 融合蛋白誘導表達條件優(yōu)化 從-80℃冰箱取出鑒定正確的含融合質(zhì)粒pGEX-4T-1-CDB3的E.coli BL21（DE3）菌種，接種于含100μg／mL Amp的LB固體培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)，挑選單個菌落接種于3mL含100μg／mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、200r／min搖菌過夜；次日按1∶50的比例取過夜菌液加入含100μg／mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37℃，300r／min搖菌；以誘導前菌液濃度［以600nm波長下的光密度值（OD600）表示，即0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0］、誘導溫度（15、25、30、37、42℃）、誘導劑IPTG濃度（0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0mmol／L）和誘導時間（2、4、6、8、10、12、16、18h）為單變量，分別誘導融合蛋白的表達，并取1 mL菌液用于后續(xù)檢測。在此基礎上，本實驗設計了4因素3水平正交試驗以進一步優(yōu)化融合蛋白的誘導表達條件，試驗設計因素及水平見表1。根據(jù)《分子克隆實驗指南（第3版）》中描述的SDS-PAGE標準操作步驟進行蛋白質(zhì)電泳［19］，然后對PAGE膠進行考馬斯亮藍染色，觀察蛋白條帶。

表1 正交試驗因素水平

1.3.2 融合蛋白表達形式的檢測 以最佳誘導條件誘導融合蛋白表達，收集菌液，4℃、6 000×g離心10min，棄上清液，留沉淀，按原體積1／10的比例加入細菌裂解緩沖液Ⅱ、苯甲基磺酰氟（PMSF，終濃度0.1mmol／L）、溶菌酶（終濃度8g／L），充分混勻，冰上緩慢振搖30min，加入脫氧膽酸鈉（終濃度8g／L）混勻并繼續(xù)振搖20min，冰上超聲裂解至液體不黏稠；4℃、12 000×g離心10min，分別收集上清（可溶性蛋白）及沉淀（包涵體），SDS-PAGE分析融合蛋白表達形式。

1.3.3 融合蛋白的Western blot鑒定 按照前述方法進行SDS-PAGE，然后根據(jù)融合蛋白大小，切取適當位置的SDSPAGE膠，從負極向正極依次放3層濾紙（面積略小于PVDF膜）、PVDF膜、膠和3層濾紙（面積略小于PVDF膜），電流穩(wěn)定100mA，轉(zhuǎn)膜3.5h；37℃、5%脫脂奶封閉2h，抗GST單克隆抗體（1∶500、1∶1 000、1∶2 000稀釋）4℃孵育過夜，1×磷酸鹽緩沖液與吐溫20混合液（PBST）洗滌3次，HRP標記羊抗小鼠IgG抗體（1∶1 000稀釋）37℃孵育1h，1×PBST洗滌3次，避光條件下加入發(fā)光液發(fā)光，顯影并定影。

1.3.4 融合蛋白的純化、透析、濃縮及保存 按最佳誘導條件擴大培養(yǎng)菌液后誘導融合蛋白表達，按上述方法收集可溶性蛋白，按SefinoseTM GST親和層析柱說明書進行蛋白純化，以SDS-PAGE驗證純化效果，以Western blot驗證純化蛋白，并將融合蛋白進行透析、濃縮，加入甘油（終濃度50%）后-20℃保存。

2 結 果

2.1 融合蛋白最佳誘導條件分析以誘導前菌液OD600、IPTG濃度、誘導溫度和誘導時間為單變量，分別對含融合質(zhì)粒pGEX-4T-1-CDB3的E.coli BL21（DE3）培養(yǎng)菌液進行誘導，結果顯示，融合蛋白誘導表達受誘導前菌液OD600的影響較小，受IPTG濃度、誘導溫度和誘導時間的影響較大，在OD600 0.8、IPTG 0.6mmol／L、誘導時間12h、溫度30℃條件下，融合蛋白的表達量相對較高，見圖1～4。經(jīng)正交試驗優(yōu)化，最終確定融合蛋白的最佳誘導條件為誘導前菌液OD600為0.8、IPTG濃度為0.6mmol／L、誘導時間為12h及誘導溫度為30℃，見圖5。

2.2融合蛋白表達形式分析SDS-PAGE分析結果顯示，融合蛋白主要以可溶性蛋白為主，其表達量約占總表達量的2／3，見圖6。

圖1 不同的誘導前菌液濃度對融合蛋白表達的影響

圖2 不同的IPTG濃度（mmol／L）對融合蛋白表達的影響

2.3 融合蛋白的Western blot鑒定利用融合蛋白中的GST標簽進行Western blot驗證，結果顯示融合蛋白相對分子質(zhì)量為100×103左右及GST標簽蛋白相對分子質(zhì)量為26×103左右，與SDS-PAGE分析結果一致；當抗GST單克隆抗體稀釋倍數(shù)為1∶500時，條帶最為明顯，表明誘導蛋白為目的融合蛋白，見圖7。

圖3 不同誘導時間對融合蛋白表達的影響

圖4 不同誘導溫度對融合蛋白表達的影響

圖5 正交試驗SDS-PAGE

圖6 融合蛋白表達形式分析

圖7 融合蛋白Western blot分析結果

2.4 純化融合蛋白的分析Western blot分析結果顯示，成功純化了融合蛋白，其純度超過90%，見圖8。

圖8 純化融合蛋白Western blot鑒定結果

3 討 論

乳糖操縱子是一種可誘導負調(diào)控型操縱子，已被廣泛應用于E.coli工程菌株的構建。E.coli BL21為蛋白酶缺陷型菌株，受T7Lac啟動子調(diào)控，IPTG誘導劑是其表達的必要條件。IPTG為乳糖結構類似物，是一種常用的高效乳糖啟動子誘導劑，可與阻遏蛋白結合形成復合物，使阻遏蛋白構象發(fā)生改變，導致阻遏蛋白與O序列解離而不能結合到Lac啟動子上，從而使乳糖操縱子能夠轉(zhuǎn)錄、誘導蛋白的表達。IPTG誘導條件簡單，可以直接進入E.coli細胞內(nèi)部發(fā)揮誘導作用，且IPTG作為一種非代謝性的誘導物，不被代謝和降解，效果持久穩(wěn)定，因此，只需極少量就能穩(wěn)定地誘導乳糖啟動子的轉(zhuǎn)錄。

優(yōu)化E.coli工程菌株誘導培養(yǎng)條件的目的在于提高融合蛋白的產(chǎn)量，降低成本。誘導過程中影響融合蛋白表達的因素較多，除菌株自身因素和表達質(zhì)粒的質(zhì)量外，還包括多種外界條件，例如誘導前菌液OD600、IPTG濃度、誘導溫度、誘導時間等。細菌的生長速率嚴重影響外源蛋白的表達，因此，必須對誘導前菌液濃度進行控制。IPTG濃度對表達水平的影響也較大。本實驗在0.1～2.0mmol／L范圍內(nèi)進行IPTG濃度調(diào)節(jié)，以尋找最佳的使用濃度。誘導溫度亦可影響E.coli中外源蛋白的表達水平，一般采用15～42℃。誘導時間過長、生長過度可加重細菌合成系統(tǒng)的負擔，導致形成包涵體，即變性蛋白。綜合以上因素，本實驗利用IPTG作為誘導物，誘導融合蛋白的表達，并對每個影響因素設置不同梯度進行反復摸索，最終通過正交試驗尋找誘導融合蛋白表達的最佳條件，從而使融合蛋白獲得高水平表達。

本實驗設計了0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.8、1.0共計8個誘導前菌液OD600水平，0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、2.0 mmol／L共計7個IPTG誘導濃度水平；2、4、6、8、10、12、16、18 h共計8個誘導時間水平，以及15、20、30、37、42℃共計5個誘導溫度水平。研究發(fā)現(xiàn)，誘導前菌液OD600、IPTG誘導濃度、誘導時間和誘導溫度對融合蛋白的表達水平都有一定影響，但誘導前菌液OD600的影響相對較小。在OD600為0.4～0.8時，融合蛋白表達量僅有小幅上升，在OD600為0.8時表達量最高，可能是由于OD600低于0.8時，細菌總數(shù)少，因而蛋白表達量低。然而，當OD600高于0.8時，細菌已處于過度生長狀態(tài)，不再處于對數(shù)生長期，細菌活力下降，死菌數(shù)目增加，目的蛋白表達量隨之減少，而雜蛋白表達量增加。融合蛋白的表達受誘導時間的影響較大，但并非誘導時間越長融合蛋白表達量越多。本實驗發(fā)現(xiàn)，在誘導時間為12h時，融合蛋白的表達水平較高，誘導時間超過12h時，其表達量的變化不明顯，且時間越長，越有利于包涵體的形成。因此，本研究選擇誘導時間為12h。IPTG濃度對融合蛋白的表達水平影響較大，但并非IPTG濃度越大融合蛋白表達量越多。本實驗發(fā)現(xiàn)，當IPTG濃度超過0.6mmol／L時，融合蛋白的表達量上升不明顯。此外，由于IPTG本身具有毒性，價格也很昂貴，且IPTG濃度過高時，誘導蛋白的表達速度過快，不利于可溶性蛋白的形成。因此，本研究選擇IPTG誘導濃度為0.6mmol／L。誘導溫度不僅影響菌體的生長，同時也影響重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性和融合蛋白的表達水平。30℃適合菌液的生長，也適合可溶性融合蛋白的表達，此時融合蛋白的表達量最大。在此基礎上，本研究設計了4因素3水平正交試驗以優(yōu)化設計，最終確定誘導前菌液OD600 0.8、誘導時間12h、IPTG誘導濃度0.6mmol／L、誘導溫度30℃為最佳誘導條件。在此誘導條件下，在相對分子質(zhì)量為100×103左右處出現(xiàn)明顯條帶，略大于融合蛋白的預期大小（相對分子質(zhì)量為97.7×103），可能與蛋白本身攜帶電荷，導致電泳條帶有一定的遷移有關。

Western blot驗證結果顯示，本研究誘導表達的蛋白可與抗GST單克隆抗體結合，因此，可以認為該融合蛋白即為艱難梭菌毒素B受體結合區(qū)CDB3融合蛋白，并且于相對分子質(zhì)量為26×103附近也出現(xiàn)弱條帶，即為GST標簽蛋白。經(jīng)表達產(chǎn)物定位分析，發(fā)現(xiàn)艱難梭菌毒素B受體結合區(qū)CDB3融合蛋白以可溶性蛋白表達為主，其原因可能是本研究采用低誘導劑濃度及低誘導溫度，使融合蛋白表達時間延長，有利于其正確折疊，也有可能是由于本研究采用帶GST標簽的載體，而GST蛋白可溶性較高，可增加融合蛋白的可溶性。經(jīng)SefinoseTMGST親和層析柱純化后，融合蛋白的純度可超過90%，經(jīng)驗證確定為艱難梭菌毒素B受體結合區(qū)CDB3融合蛋白，可用作單克隆抗體制備中的小鼠免疫抗原及雜交瘤細胞篩選蛋白。

本研究成功優(yōu)化了艱難梭菌毒素B受體結合區(qū)CDB3融合蛋白的誘導表達條件，并獲得了高水平表達的融合蛋白，且以可溶性蛋白表達為主。本研究成果為后續(xù)單克隆抗體的制備奠定了基礎。

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