Nr4a2過表達(dá)慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定*

王曉曉 付文玉 莊文欣 王倩 劉宗昱 劉金城

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)省級重點實驗室 山東濰坊 261053;2.濰坊醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室 山東濰坊 261053;3.濰坊醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)研究實驗中心 山東濰坊 261053)

孤兒核受體Nr4a2(又稱Nurr1/NOT/TINUR),屬于核甾體/甲狀腺激素受體超家族成員,是一類獨立的核受體轉(zhuǎn)錄因子[1]。研究發(fā)現(xiàn)NR4A2基因?qū)χ心X多巴胺(dopamine,DA)能神經(jīng)元的分化和存活起關(guān)鍵作用。本實驗構(gòu)建過表達(dá)Nr4a2基因的慢病毒質(zhì)粒,以增強型綠色熒光蛋白(enhanced green fluorescent protein,EGFP)為報告基因,動態(tài)觀察NR4A2在轉(zhuǎn)染細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)、分布及效應(yīng),為基因治療帕金森病(Parkinson’s disease,PD)提供實驗依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

健康Sprague-Dawley(SD)大鼠,由山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司質(zhì)檢中心實驗動物室(實驗動物生產(chǎn)許可證號:SCXK魯20130001)提供;293T細(xì)胞由我院免疫學(xué)重點實驗室惠贈,GV287載體,AgeI/AgeI酶切,pHelper1.0載體、pHelper2.0載體均購自上海吉凱基因化學(xué)技術(shù)有限公司;大腸桿菌DH5α、無內(nèi)毒素質(zhì)粒中提試劑盒購自康為世紀(jì)有限公司;PCR擴增引物、Trizol RNA提取試劑盒、購自上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、高保真Prime STARTM HS DNA Polymerase、限制性內(nèi)切酶、DL2000 DNA Marker購自寶生物工程(大連)有限公司;D M E M-高糖培養(yǎng)基、O p t i-M e M、Lipofectamine2000 Reagent購自Life technologies公司。

1.2 儀器與設(shè)備

PCR儀、低溫超速離心機、紫外分光光度計、倒置熒光顯微鏡為德國Eppendorf公司產(chǎn)品;BiospectrumAC凝膠成像分析系統(tǒng)為美國UVP公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 Nr4a2目的基因片段的獲取

根據(jù)NCBI發(fā)表的大鼠Nr4a2基因序列,設(shè)計合成一對引物。Nr4a2上游引物:5’GAG GAT CCC CGG GTA CCG GTC GCC ACC ATG CCT TGT GTT CAG GCG 3’,Nr4a2下游引物:5’TCC TTG TAG TCC ATA CCG AAA GGT AAG GTG TCC AGG 3’,由上海吉凱基因有限公司合成,該對引物所擴增的Nr4a2基因條帶大小為1838bp。

1.3.2 重組慢病毒質(zhì)粒GV287-Nr4a2的構(gòu)建

用限制性內(nèi)切酶AgeI/AgeI對純化的GV287質(zhì)粒進(jìn)行酶切,將純化回收的1838bp大小的目的片段與酶切后線性化的GV287質(zhì)粒用T4DNA連接酶連接,4℃過夜。轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌后,涂板,挑取陽性單克隆接種到5mlLB液體培養(yǎng)基中,37℃振蕩培養(yǎng)約12h,用小量質(zhì)?；厥赵噭┖谐樘豳|(zhì)粒。PCR反應(yīng)鑒定陽性細(xì)菌克隆,并將陽性克隆的菌液送測序。

1.3.3 重組慢病毒質(zhì)粒GV287-Nr4a2的包裝及滴度檢測

將重組慢病毒質(zhì)粒GV287-Nr4a2(20μg)、pHelper1.0載體(15 μg)、pHelper2.0(10μg)的混合液經(jīng)Opti-MeM 2.5ml稀釋后,室溫靜置5min后與Lipofectamine2000混勻,室溫靜置20min,將混合液轉(zhuǎn)移至293T細(xì)胞培養(yǎng)液中,37℃、5%CO2常規(guī)培養(yǎng)8h后換液,收集轉(zhuǎn)染后48h的293T細(xì)胞上清。4℃,4000g離心,過濾上清于過濾器中,4000g離心15min,收集病毒濃縮液并送上海吉凱基因有限公司進(jìn)行滴度檢測,通過比較對照組和樣品組的Ct值差異判斷滴度值,通常認(rèn)為Ct值相差2以上存在顯著差異。

1.3.4 慢病毒LV-Nr4a2瞬時轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞

以5×104細(xì)胞/ml密度接種293T細(xì)胞于6孔板中(每孔1ml),37℃,5%CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)達(dá)到30%-50% 融合后,以病毒滴度為1×107,MOI=10將LV-Nr4a2感染293T細(xì)胞,轉(zhuǎn)染6h后更換普通培養(yǎng)基,常規(guī)培養(yǎng)72h后于倒置熒光顯微鏡下觀察感染效率。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增Nr4a2基因片段及陽性克隆的鑒定結(jié)果

PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析,基因片段的大小為1838bp,與預(yù)期一致。將擴增的目的基因Nr4a2交換入線性化GV287載體后,PCR鑒定結(jié)果表明,陽性轉(zhuǎn)化子PCR產(chǎn)物大小約為1838bp,與預(yù)期相符。對PCR鑒定成功的陽性轉(zhuǎn)化子GV287-Nr4a2克隆送上海生工進(jìn)行測序,測序結(jié)果經(jīng)VectorNTI軟件與Nr4a2基因Genebank登錄序列比對,堿基序列完全一致。

2.2 慢病毒滴度檢測結(jié)果

在本次滴度檢測中,10-4μl組與對照組樣品的Ct值存在2個左右差異,因此可以認(rèn)為在10-4μl組中存在病毒顆粒。假定該組樣品中含有至少1個病毒顆粒,則病毒的滴度為1/(1.0×10-4μl)×20＝2.0×105TU/μl＝2.0×108TU/ml。

2.3 慢病毒感染293T細(xì)胞的效率

圖一 293T細(xì)胞感染慢病毒質(zhì)粒LV-Nr4a2 72h后結(jié)果A:轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒LV-Nr4a2 (熒光100× )C:轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒LV-Nr4a2(100×)B:轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒LV-Nr4a2 (熒光200× )D:轉(zhuǎn)染慢病毒質(zhì)粒LV-Nr4a2(200×)

慢病毒感染293T細(xì)胞72h后,倒置熒光顯微鏡下可觀察到大量綠色熒光的表達(dá),表明慢病毒成功感染293T細(xì)胞并成功表達(dá)Nr4a2蛋白。(見圖一)

3 討論

慢病毒載體是以人類免疫缺陷型病毒為基礎(chǔ)發(fā)展起來的基因治療載體,通過自身RNA為模板在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成雙鏈DNA,并通過整合酶作用將目的基因整合到宿主染色體上。本實驗采用的慢病毒載體系統(tǒng)由GV287載體、pHelper1.0載體、pHelper2.0載體組成,其對分裂細(xì)胞和非分裂細(xì)胞均具有感染能力,同時不受細(xì)胞分裂影響,其可以在體內(nèi)較長期地表達(dá)且安全性高。由于上述載體均為假型病毒,病毒感染目的細(xì)胞后不再具有感染能力,也不會在宿主細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生新的病毒顆粒［2］。因此該慢病毒系統(tǒng)具有較好的安全性、靶向性。

近年來研究顯示,Nr4a2基因與中腦黑質(zhì)DA能神經(jīng)元前體細(xì)胞向DA能神經(jīng)元方向分化及DA能神經(jīng)元發(fā)育成熟、遷移和存活關(guān)系密切[3-4]。轉(zhuǎn)染Nr4a2基因的骨髓MSCs[5]、神經(jīng)干細(xì)胞[6]可以成功分化為DA能神經(jīng)元并且移植治療PD動物模型有效,本實驗通過重組慢病毒技術(shù)成功構(gòu)建了過表達(dá)Nr4a2基因的慢病毒載體,濃縮后的病毒顆粒成功轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡下可以觀察到細(xì)胞內(nèi)EGFP的高度表達(dá),感染效率達(dá)到70%,證明質(zhì)粒構(gòu)建合理并在細(xì)胞中具有良好表達(dá)活性。

綜上所述,本研究采用重組慢病毒技術(shù)成功構(gòu)建重組慢病毒質(zhì)粒GV287-Nr4a2,為進(jìn)一步獲得穩(wěn)定表達(dá)Nr4a2蛋白的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞模型奠定了基礎(chǔ)。

[1]WANG Z,BENOIT G,LIU J,et al.Structure and function of Nurr1 identifies a class of ligand-independent nuclear receptors[J].Nature,2003,423(6939):555-560.

[2]COCKRELL A S,KAFRI T.Gene delibery by lentivirus vectors[J].Mol Biotechnol,2007,36(3):184-204.

[3]MARTINAT C,BACCI JJ,LEETE T,et al.Cooperative transcription activation by Nurr1 and Pitx3 induces embryonic stem cell maturation to the midbrain dopamine neuron phenotype[J].Proc Natl Acad Sci USA,2006,103(8):2874-2879.

[4]PARK CH,KANG JS,KIM JS,et al.Differential actions of the proneural genes encoding Mash1 and neurogenins in Nurr1-induced dopamine neuron differentiation[J].Cell Sci,2006,119(11):2310-2320.

[5]XU HW,SUN SL.Comparison of transplantation of mesenchymal stem cells and Nurrl-overexpressing mesenchym al stem cells with fetal ventral mesencephalic cells in Parkinson disease rat model[J].Journal of Chinese Practical Diagnosis and Therap,2011,25(10):967-969.Chinese.

[6]Tan XF,Tian ML,Jin GH,et a1.The induced differentiation of neural stem cells into dopaminergic neurons by Nurrl gene overexpression[J].Acta Anatomica Sinica,2011,42(2):18-23.Chinese.