人參皂苷糖苷水解酶高產(chǎn)菌株CGMCC No.4316發(fā)酵工藝*

孫曉雨，呂國(guó)忠，謝明杰，趙志慧，孫曉東，蘇丹

1(遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，遼寧大連，116029)2(大連民族學(xué)院環(huán)境與資源學(xué)院，遼寧大連，116600)

人參皂苷為人參及其制品的主要活性成分，因其分子結(jié)構(gòu)中糖基側(cè)鏈的不同而顯示不同的藥理特性和藥物活性［1］，將人參皂苷有效成分開發(fā)成臨床藥物及保健品已成當(dāng)今醫(yī)藥市場(chǎng)的一大熱點(diǎn)，然而由于天然產(chǎn)物大多含量低、可吸收性差、價(jià)格昂貴，過度開發(fā)及濫用對(duì)自然資源和人文環(huán)境造成無法挽救的破壞和損失。因此，利用藥材本身的次生代謝產(chǎn)物開展有效成分高產(chǎn)率人參皂苷定向轉(zhuǎn)化技術(shù)研究具有極大的優(yōu)勢(shì)和潛力。如何將含量較高的人參皂苷轉(zhuǎn)化成含量極低的人參皂苷，即將醫(yī)藥價(jià)值低的皂苷轉(zhuǎn)化為稀有皂苷，是人參皂苷轉(zhuǎn)化研究的熱門課題［2］。例如將人參皂苷Rb1、Rb2、Rc、Re等轉(zhuǎn)化成人參皂苷Rd、F1、Rh1、Rh2、compound Y、compound K 等。人參皂苷 Rd能促進(jìn) T細(xì)胞增殖，提高天然殺傷細(xì)胞(NK)的活性［3］;人參皂苷 Rh2具有明顯的抑腫瘤作用［4］。針對(duì)活性較低的人參皂苷的糖基，進(jìn)行有目的的修飾和水解，是生產(chǎn)高活性人參皂苷的有效方法［5］。目前，相關(guān)領(lǐng)域多采用傳統(tǒng)化學(xué)法［6］、微生物發(fā)酵法、酶法［7］等分離制備人參皂苷。其中，化學(xué)方法存在選擇性低、提取效率低、環(huán)境危害大等諸多缺陷，化學(xué)合成至今尚未成功。相比之下，微生物方法具有資源豐富、反應(yīng)條件溫和、底物特異性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)成為制備稀有皂苷的最佳途徑。從人參根內(nèi)分離獲得的專利菌株CGMCC No．4316(灰綠梨頭霉Absidia glauca)具有將人參皂苷Rb1專一轉(zhuǎn)化成稀有人參皂苷Rd的活性，轉(zhuǎn)化過程徹底且無其他副產(chǎn)物生成。本文對(duì)其產(chǎn)人參皂苷β-葡萄糖苷酶的培養(yǎng)基組分配比和培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究，探索合適的工業(yè)生產(chǎn)條件，以期為實(shí)現(xiàn)人參皂苷Rd的規(guī)?；a(chǎn)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種灰綠犁頭霉Absidia glauca CGMCC No．4316系本實(shí)驗(yàn)室分離、篩選和保存的專利菌株;人參皂苷單體化合物標(biāo)準(zhǔn)品Rb1、Rd購(gòu)自吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院;薄層層析板Silica Gel-60F254為德國(guó)MERCK公司產(chǎn)品;人參皂苷粉由遼寧本溪恒仁陽(yáng)光保健品有限公司提供;其他試劑均為分析純。

1.2 培養(yǎng)基

斜面培養(yǎng)基:PDA培養(yǎng)基。

種子發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖 2．0，MgSO4·7H2O 0．5，CaCl21，黃豆餅粉10。

液體產(chǎn)酶培養(yǎng)基(g/L):麩皮20，蛋白胨1．0，KH2PO41．0，自然 pH，121 ℃滅菌 30 min。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1．3．1 發(fā)酵方法

將冰箱4℃下保藏的菌株 CGMCC No．4316經(jīng)PDA斜面培養(yǎng)活化后，接入種子發(fā)酵培養(yǎng)液，在轉(zhuǎn)速(200 ±5)r/min、(30 ±0．5)℃下恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)18 h。然后轉(zhuǎn)入液體發(fā)酵培養(yǎng)基，250 mL搖瓶中加入45 mL液體培養(yǎng)基，接種量為3%(菌懸液中孢子含量為106個(gè)孢子/mL)，于30℃、160 r/min培養(yǎng)72 h，加入2%(m/v)人參根皂苷粉(人參皂苷含量75%)，繼續(xù)轉(zhuǎn)化36 h，發(fā)酵結(jié)束。上述發(fā)酵條件設(shè)置3個(gè)重復(fù)，結(jié)果取平均值。

1．3．2 酶液和生物量的制備

待上述發(fā)酵液在8 000 r/min下離心10 min，收集上清液，即為粗酶液。取沉淀收集菌絲體，經(jīng)真空抽提后于100℃電熱恒溫烘至恒重后稱量菌絲體干重，確定生物量［8］。

1．3．3 酶活力的測(cè)定

取1 mg/mol(以0．02 mol/L，pH 5．0，HAc-cNaAc緩沖液配制而成)人參皂苷Rb1底物與酶液各0．1 mL于1 mL EP管中，40℃下反應(yīng)24 h后加入0．2 mL水飽和正丁醇萃取溶劑，取上層10 μL作薄層色譜分析(TLC)。展開劑為氯仿∶甲醇∶水(70∶30∶5)，展開約6 cm，揮干溶劑，噴灑10%硫酸-乙醇加熱顯色，根據(jù)斑點(diǎn)顏色深淺確定酶反應(yīng)進(jìn)度，利用Band-scan工具軟件，對(duì)TLC圖譜進(jìn)行產(chǎn)物含量分析并計(jì)算酶活力。

酶活力定義:一定溫度下，人參皂苷Rb1底物等體積反應(yīng)24 h后，每小時(shí)轉(zhuǎn)化生成0．1 mg人參皂苷Rd所需的酶量，定義為1個(gè)酶活力單位。

1．3．4 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

保持培養(yǎng)基其他組分不變，分別改變其中的碳源、氮源、金屬離子、pH、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間、瓶裝量、搖瓶轉(zhuǎn)數(shù)、底物投料量等培養(yǎng)條件，經(jīng)過72 h搖床培養(yǎng)后測(cè)定相應(yīng)酶活力和生物量，篩選出影響人參皂苷水解酶活力的關(guān)鍵因素。

1．3．5 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

采用Design Expert軟件設(shè)計(jì)試驗(yàn)，運(yùn)用BBD中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，依據(jù)多項(xiàng)模擬方程擬合試驗(yàn)對(duì)影響CGMCC No．4316產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的關(guān)鍵因素作進(jìn)一步研究，分析優(yōu)化發(fā)酵最佳產(chǎn)酶條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分配比優(yōu)化

2．1．1 不同碳源對(duì)產(chǎn)酶量的影響

以原始產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以3．0%葡萄糖、果糖、蔗糖，麥麩皮和淀粉作為碳源，按照1．3．1發(fā)酵方法進(jìn)行培養(yǎng)，相同濃度下測(cè)定酶活，確定最佳碳源。結(jié)果顯示，麥麩皮相對(duì)于其他碳源轉(zhuǎn)化效果好(見圖1)。

2．1．2 不同氮源對(duì)產(chǎn)酶量的影響

以原始產(chǎn)酶培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別以 3．0%NaNO3、(NH4)2SO4、蛋白胨、花生粉、酵母粉、豆粕粉作為氮源，相同濃度下測(cè)定酶活，確定最佳氮源。由圖2可知，豆粕粉明顯優(yōu)于其他碳源，底物轉(zhuǎn)化徹底，酶活力最高，達(dá)到90．4 U/mL。

圖1 碳源對(duì)產(chǎn)酶量的影響Fig．1 Effect of carbon source on enzyme production

圖2 氮源對(duì)產(chǎn)酶量的影響Fig．2 Effect of nitrogen source on enzyme production

2．1．3 金屬離子對(duì)產(chǎn)酶量的影響

在液體發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基中，分別以 K+、Mn+、Zn2+、Fe3+、Mg2+、Hg+、Cu2+、Ag+、Ca2+形式加入，加入量均為0．1%。以不加金屬離子為空白對(duì)照，按照上述發(fā)酵方法測(cè)定酶活。結(jié)果顯示，Cu2+對(duì)該菌產(chǎn)酶有明顯的抑制作用，Ca2+則可以一定程度激活該菌生長(zhǎng)和代謝，從而提高產(chǎn)酶能力，其他金屬離子對(duì)產(chǎn)酶結(jié)果無明顯影響。

2.2 培養(yǎng)條件優(yōu)化

2．2．1 pH 對(duì)產(chǎn)酶量的影響

分別用1 mol/L HCl和1 mol/L NaOH調(diào)節(jié)酸堿度，測(cè)定不同初始 pH(3．0、4．0、5．0、6．0、7．0、8．0、9．0)對(duì)β-葡萄糖苷酶酶活力的影響，試驗(yàn)結(jié)果(圖3)表明，初始pH 3．0時(shí)產(chǎn)酶量和生物量均處于最低水平，pH 5．0，酶活力最高，達(dá)到85 U/mL以上，菌絲體產(chǎn)量則達(dá)到最大值11．867 mg/mL。

2．2．2 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶量的影響

圖3 pH對(duì)產(chǎn)酶量和生物量的影響Fig．3 Effect of pH on enzyme production and biomass

按照上述培養(yǎng)基配比及培養(yǎng)條件，測(cè)定不同轉(zhuǎn)化時(shí)間(24、48、72、84、96、120 及130 h)產(chǎn)酶情況，試驗(yàn)結(jié)果(圖4)表明，隨著時(shí)間推移，產(chǎn)酶量和生物量均呈現(xiàn)先升后降的趨勢(shì)，在72 h兩者數(shù)值均達(dá)到高峰，繼續(xù)培養(yǎng)，增加幅度緩慢，隨之產(chǎn)量下降，確定72 h為發(fā)酵產(chǎn)酶的最佳時(shí)間。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)酶量和生物量的影響Fig．4 Effect offermentation time on enzyme production and biomass

2．2．3 發(fā)酵溫度對(duì)產(chǎn)酶量的影響

按照上述培養(yǎng)基配比及培養(yǎng)條件，考察不同發(fā)酵溫度(25、30、35、40、45 ℃)對(duì)底物的轉(zhuǎn)化情況。試驗(yàn)結(jié)果表明，在25～35℃隨溫度增加，其產(chǎn)酶量增加，生長(zhǎng)代謝加速，但超過40℃，菌體出現(xiàn)衰老自溶現(xiàn)象，酶逐漸失活。因此，確定最佳發(fā)酵溫度為30℃。

2．2．4 瓶裝量對(duì)產(chǎn)酶量的影響

250 mL 三角瓶中分別裝入25、45、65、85、105 mL上述培養(yǎng)基成分，測(cè)定酶活力以確定最佳裝瓶體積。試驗(yàn)結(jié)果(圖5)表明，搖瓶的通氣效果和裝瓶體積呈反比，菌絲體產(chǎn)量隨著裝瓶量的增加而增加，但達(dá)到45 mL后，增加幅度不顯著，但以45～65 mL瓶裝量時(shí)產(chǎn)酶量較高。因此，最適瓶裝量為45 mL/250 mL搖瓶。

2．2．5 搖瓶轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)產(chǎn)酶量的影響

按照上述篩選獲得的最佳發(fā)酵條件，將培養(yǎng)基分裝置于 100、140、160、180、200、220 r/min 下均轉(zhuǎn)72 h，考察通氣量對(duì)產(chǎn)酶量的影響(圖6)。試驗(yàn)結(jié)果表明，轉(zhuǎn)數(shù)低于160 r/min菌體長(zhǎng)勢(shì)緩滯;轉(zhuǎn)數(shù)高于200 r/min，菌絲體由于剪切增值，致使產(chǎn)酶量大幅度降低，因此，選擇最終轉(zhuǎn)數(shù)為180 r/min。

圖5 瓶裝量對(duì)產(chǎn)酶量和生物量的影響Fig．5 Effect ofmedium volume on enzyme production and biomass

圖6 搖瓶轉(zhuǎn)數(shù)對(duì)產(chǎn)酶量的影響圖Fig．6Effect of shaking speed on enzyme production

2．2．6 底物投料量對(duì)產(chǎn)酶量的影響

在以上最佳培養(yǎng)基配比和培養(yǎng)條件的基礎(chǔ)上，加入底物人參根皂苷粉1%、2%、3%、4%、5%、6%，考察不同投料量對(duì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)酶量的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，底物人參根皂苷粉末濃度10～20 mg/mL時(shí)，酶活力達(dá)84 U/mL以上，但隨著底物量增加，產(chǎn)酶量有所降低(圖7)。

圖7 底物投料量對(duì)產(chǎn)酶量的影響Fig．7 Effect of substrate concentration on enzyme production

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化工藝

2．3．1 二次回歸擬合及方差分析［9］

根據(jù)上述單因子試驗(yàn)結(jié)果，以培養(yǎng)基中對(duì)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶活力影響較大的麥麩皮、蛋白胨和投料量3個(gè)因素為自變量，酶活力為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。因素水平選取及編碼見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

表1 因素水平設(shè)計(jì)與編碼Table 1 factor level design and coding

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果Table 2 design scheme and test results

2．3．2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果分析

運(yùn)用 D esign Expert 8．0軟件對(duì)上述試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸擬合，選擇對(duì)響應(yīng)值有顯著影響的各項(xiàng)建立二次多元回歸方程:Y=91．85+1．14A+0．19B+0．57C-1．23AB+0．16AC-1．47BC-7．73A2-5．48B2+0．23C2。

經(jīng)方差顯著性檢驗(yàn)分析可知，該模型回歸極顯著(F=11．59，P=0．002 0)，此方程校正總決定系數(shù) R2=0．937 1，R2Adj=0．8563，說明各部分試驗(yàn)自變量與響應(yīng)值之間線性關(guān)系顯著，因此，該模型預(yù)測(cè)性與擬合性良好，可以作為CGMCC No．4316產(chǎn)β-葡萄糖苷酶試驗(yàn)的理論推測(cè)。由F值判斷因子的有效率為麥麩皮(A)＞投料量(C)＞蛋白胨(B)。其中麥麩皮和蛋白胨的相互作用影響極差明顯，優(yōu)化結(jié)果見響應(yīng)面曲線圖(圖8)和等高線圖(圖9)。通過響應(yīng)面設(shè)計(jì)的最優(yōu)組合為:麥麩皮 20．47 g/L、蛋白胨 9．74 g/L、投料量10%，酶活力可達(dá)92．793 U/mL。在響應(yīng)面優(yōu)化實(shí)驗(yàn)值下進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，驗(yàn)證結(jié)果顯示，預(yù)測(cè)值與實(shí)際值幾乎吻合。因此，該模型能夠理想地預(yù)測(cè)CGMCC No．4316菌株的發(fā)酵產(chǎn)酶情況。

圖8 各因素交叉作用對(duì)產(chǎn)酶量影響響應(yīng)面曲線圖Fig．8 Response surface plots showing the cross effects of factors on enzyme production

圖9 各因素交叉作用對(duì)產(chǎn)酶量影響等高線圖Fig．9 Line chart on highershowing the cross effects of factors on enzyme production

3 討論

人參皂苷Rd是二醇型人參皂苷Rb1在人體腸道內(nèi)的主要代謝產(chǎn)物之一，具有廣泛的生物活性和生理作用。Rd的天然產(chǎn)量低，需從人參、三七、西洋參等藥用植物的根、莖、葉中提取以滿足醫(yī)療和科研的需要。該單體化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，采用傳統(tǒng)加熱法、酸堿水解法可以使主要人參皂苷糖苷配基水解生成Rd［10］，但因其反應(yīng)條件劇烈，水解過程易發(fā)生脫水、差向異構(gòu)、羥基化等副作用，目標(biāo)產(chǎn)物很難形成。迄今為止，生物轉(zhuǎn)化方法顯示出立體選擇區(qū)域較強(qiáng)、副產(chǎn)物單一等優(yōu)勢(shì)，這就使得生物轉(zhuǎn)化制備稀有人參皂苷備受青睞。

近期的研究表明，能夠水解人參皂苷的酶多數(shù)來自于細(xì)菌(如 Caulobacter leidyia［11］)、霉菌(如 Absidia［12］)、植物(如 Panax ginseng［13］)。不同來源的真菌具有相似的酶解途徑和水解特性［14］，但各菌產(chǎn)酶能力及酶蛋白活性卻各不相同，Son等［15］利用Thermus caldophilus可產(chǎn)生將主要人參皂苷Rb1轉(zhuǎn)化成Rd的中間產(chǎn)物β-葡萄糖苷酶，但由于其抑制作用，反應(yīng)時(shí)間延長(zhǎng)30倍;Karikura等［16］研究表明腸道酶能將Rb1代謝為Rd，但在胃酸作用下Rb1不能徹底轉(zhuǎn)化;Fu［17］從西洋參中分離出的大型藥食兼用菌作為發(fā)酵菌株，為制備稀有人參皂苷Rd、Rb2、compound K提供參考，但由于其轉(zhuǎn)化過程中轉(zhuǎn)化產(chǎn)物不專一，底物對(duì)酶具有抑制作用。本文利用的灰綠犁頭霉是從人參根內(nèi)分離獲得接合菌，在長(zhǎng)期穩(wěn)定的共生環(huán)境中可產(chǎn)生某種激素成分，促進(jìn)人參生產(chǎn)或者增加人參的抗病能力。此外，由于該菌擁有轉(zhuǎn)化底物及產(chǎn)物的專一性，有望應(yīng)用于發(fā)酵罐進(jìn)行大規(guī)模工廠化生產(chǎn)醫(yī)療保健領(lǐng)域的Rd單體制備。

本研究利用人參根內(nèi)分離鑒定的CGMCC No．4316菌株對(duì)Rb1進(jìn)行發(fā)酵產(chǎn)酶條件研究，通過TLC薄層圖譜對(duì)照，計(jì)算機(jī)輔助優(yōu)化分析模型，單因素設(shè)計(jì)試驗(yàn)進(jìn)行發(fā)酵條件優(yōu)化，初步選出對(duì)人參皂苷糖苷酶活力有較大影響的關(guān)鍵因素作響應(yīng)面分析［18］，在此基礎(chǔ)上綜合測(cè)定麥麩皮、蛋白胨及投料量對(duì)產(chǎn)酶量的進(jìn)一步影響。借助Design Expert 8．0軟件建立相關(guān)因素的數(shù)學(xué)模型，進(jìn)而利用響應(yīng)面回歸分析獲得二次多項(xiàng)式擬合方程［19］，由校正系數(shù)及極差比較得出最優(yōu)因子成分配比，獲得了 CGMCC No．4316菌株轉(zhuǎn)化Rb1生成Rd的最佳發(fā)酵工藝條件。研究結(jié)果表明，以麥麩皮20．47 g/L為碳源，蛋白胨9．74 g/L 為氮源，初始 pH 6．0，瓶裝量 45 mL/250 mL，搖瓶轉(zhuǎn)數(shù)180 r/min，投料量10%，30℃發(fā)酵72 h，其酶活力達(dá)到 92．78 U/mL。周偉［20］研究發(fā)現(xiàn)產(chǎn)酶培養(yǎng)基的組成和配比對(duì)天然藥物產(chǎn)量的提高以及產(chǎn)物單一性具有決定性作用。本研究從碳、氮搭配合適，pH、溫度調(diào)配恰當(dāng)，轉(zhuǎn)數(shù)和裝瓶量適宜，原料經(jīng)濟(jì)合理幾個(gè)方面著手，通過多種途徑及不同原料配伍試驗(yàn)，可以在最短時(shí)間內(nèi)迅速形成大量菌體，大幅度提高人參皂苷糖苷酶的活力，從而為獲得大量、高純度的人參皂苷Rd起到了一定的指導(dǎo)作用。此外，對(duì)于該內(nèi)生菌產(chǎn)生的酶活性、酶性質(zhì)以酶催化作用等問題，還有待深入探討和研究。

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