臍橙中6種功效成分RP-HPLC檢測方法的建立

勾中智，徐維盛，劉靜，易有金，楊月欣，*

（1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，湖南長沙410128；2.中國疾病預(yù)防控制中心營養(yǎng)與食品安全所，北京100050；3.北京市科學(xué)技術(shù)研究院北京市營養(yǎng)源研究所，北京100069）

臍橙，屬無患子目、蕓香科、柑橘屬類水果[1]。柑橘類水果富含多種活性成分，對人體健康有預(yù)防和保健的作用，目前已經(jīng)從柑橘中鑒定出的類黃酮物質(zhì)有60多種[2]，主要包括：黃酮類、黃酮醇類、黃烷酮類以及花色苷類，其中黃烷酮類含量最高，約占類黃酮總量的80%[3]，檸檬苦素類化合物檸檬苦素及諾米林也具有較高的含量。目前，柑橘類水果中黃酮類及檸檬苦素類功效成分的檢測方法主要包括高效液相色譜法[4-9]、超高效液相色譜技術(shù)（UPLC）[10-11]、液-質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（LC-MS）[12-15]、液-核聯(lián)用技術(shù)（LC-NMR）[16]等。目前柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林等6種黃酮類和檸檬苦素類物質(zhì)的同時檢測方法尚未見文獻報道，本文首次建立了該6種功效成分同時檢測的RP-HPLC檢測方法，并測定了其在臍橙中的含量，獲得了滿意的結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀，DAD檢測器，四元梯度泵，Chemical station色譜工作站：美國安捷倫公司；ME235S型分析天平：德國Sartorius集團；EYECA OSB-2100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海愛朗儀器有限公司；SHB-Ш型循環(huán)水式多用真空泵：鄭州長城科工貿(mào)有限公司；YKKY DX-208型低溫循環(huán)機：北京長流科學(xué)儀器公司；KQ-500 DE型數(shù)控超聲波清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品與樣品

柚皮苷（批號：15495000-20917）、橙皮苷（批號：14140000-10428），均購于 Dr.Ehrenstorfer GmbH；柚皮素（批號：CDHJ-STA-02206006）、橙皮素（批號：CDHJSTA-67900000）、檸檬苦素（CDHJ-STA-28543004）、諾米林（批號：CDHJ-STA-77000000）均購于上海詩丹德生物技術(shù)有限公司；贛南臍橙和秭歸臍橙由江西省臍橙工程技術(shù)研究中心提供；美國新奇士臍橙購于北京新發(fā)地水果市場。

1.3 試劑

乙腈（色譜純，F(xiàn)isher Chemical）；磷酸（分析純，北京化學(xué)試劑公司）；甲醇（分析純，北京化學(xué)試劑公司）；二甲基亞砜（分析純，天津光復(fù)化學(xué)試劑公司）；實驗用水為雙蒸水。

1.4 方法

1.4.1 樣品提取

臍橙去皮，將可食部分勻漿處理，稱取5.0 g，按照1∶10（g/mL）料液比加入80%甲醇水和二甲基亞砜（v∶v=1 ∶1），超聲輔助提取，提取 30 min，過濾，濾渣重復(fù)提取一次，合并兩次濾液，用80%甲醇水和二甲基亞砜（v∶v=1∶1）定容于100 mL容量瓶中，作為供試品溶液，使用前過0.45 μm濾膜。

1.4.2 色譜條件

色譜柱：色譜柱：Agilent Eclipse XDB C18（4.6×250 mm，5 μm）；流動相：A 相：0.1%磷酸水；B 相：乙腈，梯度洗脫：梯度洗脫，A相：0.1%磷酸水；B相：乙腈，洗脫程序：23%B 等度（0～5 min）；23%～55%B 線性變換（5 min～10 min）；55%B 等度（10 min～25 min）；檢測波長：波長切換技術(shù)，0～13 min：285 nm；13 min～25 min：210 nm。柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；進樣量：10 μL。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液配制

1.4.3.1 單一標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取柚皮苷、橙皮苷、檸檬苦素、諾米林各4.0 mg分別置于25 mL容量瓶中，橙皮素、柚皮素各4.0 mg分別置于100 mL容量瓶中，用80%甲醇水和二甲基亞砜（v∶v=1∶1）溶解，配制成濃度分別為160、40 μg/mL 單一標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.4.3.2 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別精密稱取柚皮苷、橙皮苷、檸檬苦素、諾米林各8.0 mg，橙皮素、柚皮素各2.0 mg分別置于500 mL容量瓶中，用80%甲醇水和二甲基亞砜（v∶v=1∶1）溶解，配制成與單標(biāo)濃度相同的混標(biāo)溶液。

1.4.4 系統(tǒng)適用性

取濃度分別為160.0、40.0 μg/mL的6種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)單標(biāo)、混標(biāo)溶液，分別量取10 μL注入高效液相色譜儀，進樣分析，采用單標(biāo)、混標(biāo)通過保留時間（±5%）及用標(biāo)樣增高法對待測樣品中的檢測成分進行定性分析，以對稱因子為指標(biāo)，考察色譜系統(tǒng)適用性。

1.4.5 線性與范圍

按1.4.3.2項下方法配制混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液，精密吸取 0.1、1、3、5、7、10 mL 至 10 mL 容量瓶中，并用 80%甲醇水和二甲基亞砜（v∶v=1∶1）的溶液定容至刻度，獲得6個不同濃度的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，精密量取10 μL注入高效液相色譜儀，進樣分析。

1.4.6 精密度試驗

量取濃度分別為160 μg/mL（柚皮苷、橙皮苷、檸檬苦素、諾米林）及40 μg/mL（橙皮素、柚皮素）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液10 μL注入高效液相色譜儀，按1.4.2項下色譜條件進樣分析，重復(fù)進樣5次，以色譜峰面積為指標(biāo)考察儀器精密度。

1.4.7 重復(fù)性試驗

取1#贛南臍橙5 g，加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5 mL，按照1.4.1項下方法提取，獲得供試品溶液，分別量取10 μL注入高效液相色譜儀，按1.4.2項下色譜條件進樣分析，計算6份樣品峰面積的RSD值，考察重復(fù)性試驗。

1.4.8 溶液穩(wěn)定性試驗

取同一份對照品溶液，室溫靜置，分別于第0、2、4、6、8、12、24 h，量取 10 μL 注入高效液相色譜儀，按1.4.2項下色譜條件進樣分析，分別計算不同時間點色譜峰面積的RSD值，考察樣品溶液穩(wěn)定性。

1.4.9 回收率試驗

取濃度分別為160 μg/mL（柚皮苷、橙皮苷、檸檬苦素、諾米林）及40 μg/mL（橙皮素、柚皮素）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，稀釋100倍作為小標(biāo)溶液，按外標(biāo)法計算獲得1#贛南臍橙中該6種功效成分的含量，均勻取樣3份，每份5 g，分別定量加入混合標(biāo)準(zhǔn)品溶液5.0 mL，按照1.4.1項下方法提取，量取10 μL注入高效液相色譜儀，按1.4.2項下色譜條件進樣分析，測定樣品的回收率。

1.4.10 定量限與檢測限

按1.4.3.1項下方法配置單一標(biāo)準(zhǔn)溶液，采用逐級稀釋法，按S/N為10計算定量限（LOQ），按照S/N=3計算檢測限（LOD）。

2 結(jié)果

2.1 系統(tǒng)適用性

臍橙中6種功效成分HPLC檢測色譜圖見圖1所示。

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品及樣品HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of standards and samples

結(jié)果表明，6種標(biāo)準(zhǔn)品在16 min內(nèi)能完全分離，且理論塔板數(shù)均＞ 3000，分離度R均＞1.5，各目標(biāo)物質(zhì)峰的對稱性也較好，各標(biāo)準(zhǔn)品化合物的保留時間具有較好的重現(xiàn)性（±5%）。

2.2 線性與范圍

以對照品溶液濃度為橫坐標(biāo)（X），以色譜峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù) R2。結(jié)果表明，在濃度 2 μg/mL～266 μg/mL 濃度范圍內(nèi)，柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林等6種成分均具有良好的線性，結(jié)果見表1。

表1 6種功效成分化合物的線性范圍、回歸方程及相關(guān)系數(shù)Table 1 Linear ranges，regression equations and correlation coefficients of 6 functional components

2.3 精密度

6種標(biāo)準(zhǔn)品柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林5次重復(fù)進樣峰面積RSD值分別為0.68%、0.94%、0.29%、0.29%、0.62%、0.16%，均＜2%，結(jié)果表明精密度良好。

2.4 重現(xiàn)性

6份樣品6種對照品柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林峰面積的RSD值分別為：0.37%、0.59%、0.77%、0.58%、0.94%、0.56%，均＜2%，表明重復(fù)性良好。

2.5 溶液穩(wěn)定性

6種標(biāo)準(zhǔn)品柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林24 h內(nèi)峰面積RSD值分別為1.62%、0.37%、1.43%、0.91%、1.25%、1.38%，均＜2%，表明6種功效成分在24 h內(nèi)溶液穩(wěn)定性良好。

2.6 回收率試驗

6種功效成分的平均回收率在94.6%～111.9%，結(jié)果表明6種功效成分均具有良好的回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率檢測結(jié)果Table 2 Recoveries of the 6 kinds of functional components

2.7 定量限與檢測限

經(jīng)計算，柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林的定量限分別為 1.59、0.74、0.62、0.40、0.47、4.77 ng；檢測限分別為：0.48、0.22、0.18、0.12、0.14、1.43 ng。

2.8 含量測定

1#贛南臍橙、2#秭歸臍橙、3#新奇士臍橙樣品的含量結(jié)果見表3。

表3 臍橙中功效成分含量測定結(jié)果Table 3 Determination results of functional components in navel orange mg/kg

結(jié)果表明3種臍橙中黃酮類物質(zhì)中含量最高為橙皮苷，順序為贛南臍橙＞秭歸臍橙＞新奇士臍橙，其中贛南臍橙高達 3302.3 mg/kg，3種臍橙中新奇士臍橙中檸檬苦素含量較高，達到176.64 mg/kg，秭歸臍橙中諾米林含量較高，達到125.3 mg/kg。

3 結(jié)論與討論

3.1 樣品的提取制備

目前黃酮類物質(zhì)提取超聲輔助提取法采用較多，均已取得較高的提取率[7，9-10]；本論文選擇超聲輔助提取，考慮到檸檬苦素類物質(zhì)特殊的溶解性能。選80%甲醇水和二甲基亞砜（v∶v=1∶1）為提取溶劑，采用四因素三水平（提取液體積分?jǐn)?shù)、提取時間、料液比和提取次數(shù)）正交試驗，確定最佳提取方法：80%甲醇和二甲基亞砜（v∶v=1∶1），超聲提取時間 30 min，料液比1∶10，提取次數(shù)2次。

3.2 檢測波長的選擇

利用二極管陣列檢測器對6種功效成分進行掃描，結(jié)果顯示：柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素在285 nm波長均有最大特征紫外吸收，檸檬苦素、諾米林在200 nm～400 nm波長范圍內(nèi)沒有特征紫外吸收，為末端吸收，經(jīng)HPLC方法學(xué)考察，本論文最終選擇雙波長切換技術(shù)，使得各種化合物均在其最大紫外吸收波下檢測，其色譜響應(yīng)值最大，獲得了滿意的結(jié)果。

3.3 流動相的選擇

由于選擇的6種功效成分結(jié)構(gòu)類型差異較大，等度洗脫分析時間較長，導(dǎo)致色譜峰柱效降低，為提高柱效節(jié)約時間，本實驗選擇梯度洗脫程序。流動相分別實驗了乙腈、甲醇與0.05%、0.1%、0.5%三個不同濃度的甲酸水、磷酸水的不同配比，考察了流動相對樣品分離度及柱效的影響。實驗結(jié)果表明，乙腈、甲醇均可實現(xiàn)6種功能成分的分離，但乙腈洗脫能力較強，可節(jié)約時間，提高柱效，故選擇乙腈為有機相。水相中酸的加入可有效抑制化合物色譜峰的拖尾現(xiàn)象，改善色譜峰峰型，提高色譜峰對稱性，但流動相的pH過低會降低色譜柱的使用壽命，綜合考慮色譜峰柱效及色譜柱的pH耐受范圍，選擇0.1%磷酸水為水相，對該6種黃酮類和檸檬苦素類化合物在16 min內(nèi)均達到基線分離，且均具有較高的柱效。

3.4 結(jié)論

本論文建立了同時檢測4種黃酮類功效成分（柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素）及2種檸檬苦素類功效成分（檸檬苦素、諾米林）的RP-HPLC檢測方法，方法學(xué)驗證結(jié)果表明，建立的方法可靠、準(zhǔn)確，可用于臍橙類水果中柚皮苷、橙皮苷、柚皮素、橙皮素、檸檬苦素、諾米林等6種功效成分的含量測定。

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