順鉑作用下卵巢癌細胞株CP70中Eps8表達變化研究＊

第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產(chǎn)科（西安710032） 王 冰 楊 勇 辛曉燕

表皮生長因子受體通路底物8（Epidermal growth factor receptor pathway substrate 8，Eps8）為廣泛表達的多域信號轉(zhuǎn)導蛋白，調(diào)節(jié)著細胞兩種完全不同的GTP依賴型生物機制：通過Ras／Rac通路影響肌動蛋白骨架的重組，以及通過Rab通路影響受體介導的細胞內(nèi)吞作用［1］。近年來，許多學者［2，3］應(yīng)用 RT－PCR（實時熒光PCR技術(shù)）、Western blot（蛋白質(zhì)印跡法）、微陣列技術(shù)、基因敲除技術(shù)等實驗方法發(fā)現(xiàn)，Eps8在乳腺癌、宮頸癌、胰腺癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、惡性血液系統(tǒng)疾病等實體腫瘤中表達異常升高，而在正常組織中未見表達或者表達較低。繼而通過分子生物實驗發(fā)現(xiàn)Eps8通過調(diào)節(jié)細胞肌動蛋白骨架影響腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲，通過調(diào)節(jié)胞質(zhì)中的溶酶體對腫瘤細胞的自噬作用，影響腫瘤的轉(zhuǎn)移。但有關(guān)Eps8在卵巢癌方面的研究，國內(nèi)外報道較少。本實驗通過 RT－PCR、Western blot方法檢測卵巢癌順鉑敏感細胞株A2780、耐藥細胞株CP70、卵巢癌細胞株SKOV3、順鉑耐藥株SKOV3／DDP中Eps8在mRNA及蛋白水平的表達情況，發(fā)現(xiàn)Eps8在順鉑耐藥細胞株CP70中高表達，采用不同濃度DDP（順鉑）處理CP70細胞后檢查Eps8蛋白表達變化情況，探討該蛋白表達的變化與DDP作用于CP70發(fā)生耐藥之間的關(guān)系，以期為卵巢癌治療提供新的思路。

材料和方法

1 細胞株和主要試劑 A2780、CP70、SKOV3、SKOV3／DDP細胞株由第四軍醫(yī)大學西京醫(yī)院婦產(chǎn)科實驗室長期凍存留種。DDP為山東齊魯制藥廠產(chǎn)品，DMEM／低糖、1640培養(yǎng)基、FBS（胎牛血清）、Penicillin－Streptomycin、胰酶均為 Hyclone產(chǎn)品，逆轉(zhuǎn)錄酶（北京天根生物技術(shù)有限公司），Real－time PCR試劑盒（南京百斯凱科技有限公司，全式金cat：AQ131－01），TRIZOL（南京百斯凱科技有限公司，全式金cat：ET111－01，lot：H10318），氯仿、異丙醇 （分析純），RNA溶解液（南京百斯凱科技有限公司，全式金cat：ET111－02，lot：H10323），DEPC（北京博奧拓達科技有限公司 Amresco cat：E174），引物合成（上海生工）：hEPS8F5’－GATGTCATTGGGAGGAACTTG－3’，hEPS8R5’－ATAAAGTTCAGCATTGGGGG－3’，hActin F 5’－GATGAGATTGGCATGGCTTT－3’，hActin R 5’－GTCACCTTCACCGTTCCAGT－3’。PMSF（南京沃宏Amresco，cat：329－98－6），cocktail（上海源 葉 生 物 科 技 有 限 公 司 cat：26305－03－3，lot：10557），PBS（pH7．0），脫 脂 奶 粉 （伊 利 cat：66196131T），兔抗人Eps8單克隆抗體（美國Abcam公司），actin（杭州華安生物cat：1854－s），羊抗鼠二抗（南京伯利德生物cat：Abmart M21001L），羊抗兔二抗（上海華安生物cat：HA1001）。

2 方 法

2．1 A2780CP70SKOV3SKOV3／DDP四株卵巢癌細胞中EPS8的mRNA表達水平的檢測：收集細胞，PBS離心洗滌2次，棄上清。往細胞沉淀中加入1ml的 Trizol，提取 A2780、CP70、SKOV3、SKOV3／DDP細胞總RNA。取總RNA 1μl進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)條件為：70℃5min，冰上冷卻2min，42℃50min，95℃5min，將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物置－20℃保存?zhèn)溆谩ＨDNA 2μl作為模板，建立25μl反應(yīng)體系，反應(yīng)條件為：95℃3min，95℃30s，55℃20s，72℃20s，共進行40個循環(huán)，72℃延伸10min，最后一步溶解曲線反應(yīng)條件：95℃15s，60℃15s，20min升溫，95℃15s。采用RQ＝2－△△CT進行計算相對表達量，以內(nèi)參基因actin為標準。CT值指反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達設(shè)定的閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。數(shù)據(jù)分析用的是EXCEL，作圖用的是Graphpad prism 5軟件，主要是利用t檢測是否有顯著性差異。

2．2 Western blot：檢測卵巢癌細胞株中 EPS8的蛋白表達水平：取對數(shù)生長期的細胞，去除培養(yǎng)液，4℃預(yù)冷的PBS清洗2次，加入蛋白裂解液100μl，冰上裂解30min，于4℃下12000rpm離心15min后，吸取上清液，BAC法測定蛋白濃度，將離心后的上清加入loading buffer，100℃5min，然后放于－80℃保存。將蛋白樣品與SDS蛋白上樣緩沖液混合后于100℃處理5min，每孔上樣100μg細胞總蛋白，電泳時濃縮膠電壓為70V；當溴酚藍品進入濃縮膠時，電壓為110V；待溴酚藍到達膠底部后，將蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF膜，麗春紅染色，封閉液室溫封閉1h后，加入適量的一抗，4℃孵育過夜。以內(nèi)參基因actin為標準，TBST清洗后，加入相應(yīng)二抗室溫孵育1h，TBST洗膜后，用ECL Reagent顯色，應(yīng)用Alpha Innotech系統(tǒng)對PVDF膜進行掃描及圖像分析。

2．3 DDP處理后 Western blot檢測卵巢癌細胞CP70中Eps8的蛋白表達水平：CP70細胞種于6孔板內(nèi)，加入不同濃度（0μM、10μM、20μM、40μM）DDP并于24h和48h后收集細胞。實驗步驟同上。

2．4 統(tǒng)計學方法：以SPSS17．0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學處理。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（mean±SD）表示。P＜0．05為具有統(tǒng)計學差異，P＜0．01為具有統(tǒng)計學顯著差異。

結(jié) 果

1 實時熒光定量PCR結(jié)果 在4株卵巢癌細胞中，Eps8在順鉑耐藥細胞株CP70中的mRNA表達最高，而在順鉑敏感株A2780中mRNA的表達最低：耐藥株CP70中Eps8mRNA是敏感株A2780的117倍，差異有統(tǒng)計學意義（圖1）。

圖1 實時熒光定量PCR－數(shù)據(jù)分析

2 Western blot結(jié)果 在內(nèi)參蛋白表達一致的情況下，卵巢癌順鉑耐藥細胞株CP70中Eps8蛋白表達明顯高于其他三種細胞株（圖2）。

圖2 WB檢測EPS8蛋白表達變化

3 順鉑處理后Eps8的表達變化 實驗以Eps8高表達的卵巢癌順鉑耐藥細胞株CP70為研究對象，采用不同濃度（10μM、20μM、40μM）的順鉑處理細胞24h、48h，以不加順鉑為空白對照組（Control）。Western blot結(jié)果表明，隨著順鉑濃度的逐漸增加，Eps8的蛋白水平表達增高，隨著順鉑作用時間的延長，Eps8的蛋白表達呈現(xiàn)明顯增強趨勢（圖3～4）。

圖3 DDP處理24h后EPS8蛋白表達水平

圖4 DDP處理48h后EPS8蛋白表達水平

討 論

Eps8作為接受器型的酪氨酸激酶受體（RTKS），受表皮生長因子受體（EGFR）以及其他RTKS磷酸化而激活。Eps8與EGFR結(jié)合后，細胞的DNA合成和癌化能力增加［4］。Eps8也是一個肌動蛋白骨架。Maria等［5］在多形膠質(zhì)細胞瘤（GBM）的三種不同細胞株中進行2D和3D實驗，發(fā)現(xiàn)通過損傷細胞骨架的突出結(jié)構(gòu)，可以達到抑制腫瘤侵襲的作用。而通過siRNA沉默Eps8，可以消除腫瘤細胞的遷移和侵襲能力。研究證實，Eps8可以調(diào)節(jié)表皮生長因子EGF依賴的小G蛋白Rac的活性，進而調(diào)控細胞骨架肌動蛋白的構(gòu)建和重排［6］。Eps8還調(diào)節(jié)Rab5的活性，參與受體介導的細胞內(nèi)吞作用，影響Ras和Rac之間的信號轉(zhuǎn)導［7］。此外，Eps8還參與多種腫瘤細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，增強促有絲分裂信號的釋放，導致腫瘤細胞的惡變［8］。Thilo Welsch等［9］發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性 Eps8在轉(zhuǎn)移性胰腺癌細胞株AsPC－1和Capan－1中定位于大泡溶酶體中，并且高表達。Eps8的異位表達增加了溶酶體的大小。結(jié)構(gòu)功能分析顯示，調(diào)節(jié)溶酶體改變的區(qū)域位于Eps8的氨基酸184～535片斷。值得注意的是，此片斷包含2個類似分子伴侶介導的細胞自噬作用所需要的KFERQ序列。此外，Eps8與Hsc70和LAMP－2的共同免疫沉淀反應(yīng)物是細胞自噬作用下降的關(guān)鍵因素。這些研究說明，在人類的一些腫瘤細胞中，Eps8通過定位于溶酶體，進而調(diào)節(jié)細胞的自噬作用，促進了癌癥腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移。Yao等［10］應(yīng)用基因表達序列分析技術(shù)和cDNA陣列比較基因組雜交技術(shù)對乳腺癌細胞進行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Eps8是一個腫瘤相關(guān)蛋白。有文獻報道，光輝霉素（Mithramycin）通過抑制Src的表達，從mRNA水平及蛋白水平減少了Eps8的表達，從而降低了人類上皮癌細胞的增殖和遷移能力［10］。Gan［11］等應(yīng)用蒽環(huán)類抗腫瘤藥物 DNR（柔紅霉素）作用于急性髓系白血病細胞株KGla，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DNR對KGla細胞的增殖有明顯抑制作用，Eps8的mRNA及蛋白表達均呈下降趨勢，因此推測DNR對于KGla細胞的殺傷抑制作用的機制之一可能是降低Eps8的表達。DDP是鉑類化療藥物中最早被合成出來的，與光輝霉素、DNR同屬于細胞周期非特異性藥物，其作用機理主要是順鉑與DNA單鏈內(nèi)兩點或雙鏈發(fā)生交叉聯(lián)結(jié)，抑制癌細胞的DNA復(fù)制過程，導致細胞凋亡［12］。本實驗應(yīng)用 RT－PCR、Western blot技術(shù)從mRNA水平和蛋白水平檢測Eps8在卵巢癌細胞株中的表達。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在4株卵巢癌細胞中，耐藥細胞株CP70中Eps8mRNA和蛋白表達最高，而和它配對的順鉑敏感細胞株A2780中Eps8mRNA和蛋白也有表達，相對較低。同樣的趨勢出現(xiàn)在SKOV3和SKOV3／DDP這對細胞中。為了進一步明確Eps8與卵巢癌順鉑耐藥之間關(guān)系，實驗設(shè)計了不同劑量、不同作用時間的順鉑作用于高表達Eps8的順鉑耐藥細胞株CP70，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，順鉑處理CP70細胞后，Eps8的蛋白表達量增高，且和DDP作用的時間及劑量有依賴性，即DDP可誘導CP70細胞中Eps8表達的上調(diào)。因此推測，Eps8可能在卵巢癌順鉑耐藥形成機制中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，Eps8的表達情況一定程度上反應(yīng)了卵巢癌細胞對順鉑的化療敏感性，這就為我們研究卵巢癌順鉑化療耐藥提供了一條新思路，Eps8是否可以成為一個新型腫瘤化療耐藥的臨床檢測指標，為臨床化療方案的選擇及評價預(yù)后提供有效依據(jù)？本研究為進一步探索Eps8在卵巢癌化療耐藥中的作用提供了實驗依據(jù)，也為卵巢癌的基因治療提供新的思路。

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