慢性丙型肝炎患者外周血中CD4+Foxp3+調(diào)節(jié)性T細胞的變化及其臨床意義

王 萍，胥 冰，張麗君(陜西中醫(yī)學(xué)院免疫教研室，咸陽 712046;通訊作者，E-mail:smilewangping@163.com)

丙型肝炎是一種由丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染機體后所引起的傳染性疾病，全世界約2億人為HCV感染者，且其中80%感染者為慢性持續(xù)感染者，慢性丙型肝炎是引起肝硬化、原發(fā)性肝癌重要原因之一。研究證實調(diào)節(jié)性 T細胞(regulatory T cell，Treg)具有免疫無能和免疫抑制兩大功能，在誘導(dǎo)和維持免疫耐受過程中發(fā)揮重要作用［1，2］。國內(nèi)外研究發(fā)現(xiàn) Treg 細胞在 HBV、HCV、HIV等病毒感染性疾病中發(fā)揮一定作用［3］。為進一步研究Treg細胞在慢性丙型肝炎中的作用，本研究擬通過對慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞、核轉(zhuǎn)錄因子Foxp3及轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)的檢測，初步探討Treg細胞在慢性丙型肝炎中的變化及其意義。

1 資料和方法

1.1 研究對象

選擇2012-06～2013-03在陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院住院和門診治療的慢性丙型肝炎患者60例，其中男性36例，女性24例，年齡20-63歲，平均年齡(37.19±14.07)歲。診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2000年中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲學(xué)分會、肝病學(xué)分會聯(lián)合修訂的《病毒性肝炎防治方案》［4］，排除標(biāo)準(zhǔn):排除甲、乙、丁、戊型肝炎及其他病毒性疾病、自身免疫性、惡性腫瘤、藥物及酒精性肝炎及嚴重心腎內(nèi)分泌疾病等。同期在陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院進行體檢的40例健康體檢者作為正常對照組，其中男性22例，女性18 例，年齡18-60 歲，平均年齡(35.67 ±12.39)歲，均排除病毒性疾病、自身免疫性疾病、腫瘤和藥物及酒精性肝炎。兩組研究對象在性別(χ2=0.246，P=0.619)、年齡(t=0.554，P=0.580)上的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

1.2 方法

1.2.1 CD4+Foxp3+Treg細胞檢測 采用流式細胞術(shù)檢測CD4+Foxp3+Treg細胞，利用人淋巴細胞分離液分離外周血單個核細胞，并調(diào)整細胞濃度為1×106個/ml。500 μl單細胞懸液加入 20 μl FITCCD4抗體，混勻后避光孵育20 min;洗滌離心后分別加入4℃ 1×固定液、37℃ 1×破膜液后洗滌重懸細胞后，加入20 μl PE-Foxp3或同型對照抗體，孵育30 min后洗滌重懸細胞。應(yīng)用FACS Calibur型流式細胞儀進行檢測，通過Cellquest軟件進行收集分析數(shù)據(jù)。

1.2.2 Foxp3 mRNA表達水平檢測 采用實時定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測Foxp3 mRNA表達水平，取 500 μl單細胞懸液，加入 1.0 ml TRIzol液提取外周血單個核細胞總RNA，利用cDNA第一鏈合成試劑盒進行第一鏈合成，以上操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。根據(jù)文獻合成 Foxp3及內(nèi)參GAPDH 引物［5］，20 μl PCR 反應(yīng)體系如下:SYBR?Premix Ex TaqTMⅡ(2 × )10 μl、PCR 上下游引物(2 μmol/L)各 2 μl、cDNA 6 μl。擴增條件為:95 ℃ 10 s預(yù)變性，95 ℃ 5 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，共45個循環(huán)。擴增結(jié)束采用2-ΔΔCt分析Foxp3 mRNA基因的相對表達。

1.2.3 血漿中TGF-β1水平檢測 無菌采集靜脈血2.0 ml，1 500 r/min 離心 10 min 分離血漿，采用酶聯(lián)免疫試吸附試劑盒檢測血漿中TGF-β1水平，每個樣本設(shè)置3個復(fù)孔。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞百分率變化

流式細胞分析(以CD4+細胞為門)結(jié)果顯示慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞百分率與正常對照組相比明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見圖 1、表1)。

圖1 慢性丙型肝炎患者外周血CD4+Foxp3+Treg細胞百分率變化Figure 1 The changes of CD4+Foxp3+Treg cells in the peripheral blood of patients with chronic hepatitis C by flow cytometry

2.2 慢性丙型肝炎患者外周血Foxp3 mRNA表達水平變化

熒光定量PCR檢測Foxp3 mRNA表達水平結(jié)果顯示:與正常對照組相比，慢性丙型肝炎患者外周血Foxp3 mRNA表達水平明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P ＜0.05，見表1)。

2.3 慢性丙型肝炎患者血漿中TGF-β1濃度變化

慢性丙型肝炎患者血漿TGF-β1水平明顯高于正常對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05，見表1)。

表1 兩組研究對象外周血中CD4+Foxp3+Treg細胞、Foxp3 mRNA、TGF-β1水平的比較Table 1 Com parison of the levels of CD4+Foxp3+Treg cells，F(xiàn)oxp3 mRNA and TGF-β1 in the peripheral b lood of patients with chronic hepatitis C between two groups

3 討論

HCV 感染機體后可以誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液免疫和細胞免疫應(yīng)答，但體液免疫不能有效地清除病毒。隨著對丙型肝炎發(fā)病機制研究的不斷深入，目前普遍認為丙型肝炎病毒造成的肝臟損傷及轉(zhuǎn)歸與機體細胞免疫功能及免疫耐受密切相關(guān)。機體免疫功能異常，不能清除HCV，導(dǎo)致病毒長期存在形成慢性感染。研究證實慢性丙型肝炎患者體內(nèi)HCV特異的CD8+和CD4+T細胞反應(yīng)活性降低，國內(nèi)外研究顯示調(diào)節(jié)性T細胞在慢性丙型肝炎的進展中起到重要的作用［6-10］。

自從1995年日本學(xué)者 Sakaguchi等［11］發(fā)現(xiàn)調(diào)節(jié)性T細胞以來，隨著研究深入認為調(diào)節(jié)性T細胞是一群獨立的細胞，Treg細胞在自身免疫性疾病、腫瘤、移植及感染性疾病中發(fā)揮重要作用［1，2］。最近研究證實Treg細胞在HCV感染中也發(fā)揮一定作用［6-10］，但研究結(jié)果并不完全一致，可能與每個研究的病例選擇、采樣時間、Treg細胞檢測分選手段不同等因素有關(guān)。目前普遍認為Foxp3是Treg細胞分化過程中關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄激活因子［12］，因此我們利用CD4+Foxp3+作為檢測Treg細胞的標(biāo)記。而Treg細胞主要通過分泌 TGF-β1來發(fā)揮作用效應(yīng)［2］，我們同時檢測了HCV患者血漿中TGF-β1的水平。實驗結(jié)果顯示慢性丙型肝炎患者CD4+Foxp3+Treg細胞百分率、Foxp3 mRNA及血漿TGF-β1水平與正常對照組相比均明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，這與國內(nèi)外的研究結(jié)果基本一致［5-9］。研究證實Treg細胞具有免疫抑制性和免疫無能性功能，其發(fā)揮抑制作用的靶細胞不區(qū)分CD4+和CD8+T細胞。在慢性丙型肝炎患者體內(nèi)CD4+Foxp3+Treg細胞增多，抑制了HCV特異性CD8+T細胞功能，不能完全清除HCV，使病毒長期存在，造成慢性感染。

綜上所述，慢性丙型肝炎患者體內(nèi) CD4+Foxp3+Treg細胞及血漿TGF-β1水平增高，發(fā)揮了免疫抑制作用，減弱HCV特異性CD8+T淋巴細胞反應(yīng)，病毒無法清除，造成 HCV慢性感染。但CD4+Foxp3+Treg細胞發(fā)揮抑制作用的信號分子及信號傳遞通路尚未完全清楚，深入研究 CD4+Foxp3+Treg細胞與慢性丙型肝炎的關(guān)系，可能為闡明丙型肝炎的慢性化機制及指導(dǎo)其治療提供理論及實驗基礎(chǔ)。

［1］Gavin MA，Rasmussen JP，F(xiàn)ontenot JD，et al.Foxp3-dependent programme of regulatory T-cell differentiation ［J］.Nature，2007，445(7129):771-775.

［2］Piccirillo CA.Regulatory T cells in health and disease［J］.Cytokine，2008，43(3):395-401.

［3］Rouse BT，Sarangi PP，Suvas S.Regulatory T cells in virus infections［J］.Immunol Rev，2006，212:272-286.

［4］中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲學(xué)會、肝病學(xué)分會.病毒性肝炎防治方案［J］.中華內(nèi)科雜志，2001，41(4):62-68.

［5］王萍，胥冰，張麗君.不同類型 HBV感染者外周血 Treg/Th17細胞的變化及意義［J］.中國免疫學(xué)雜志，2013，29(6):618-621.

［6］Wang JP，Zhang Y，Wei X，et al.Circulating Toll-like receptor(TLR)2，TLR4，and regulatory T cells in patients with chronic hepatitis C［J］.APMIS，2010，118(4):261-270.

［7］陳志剛，左維澤，周迪，等.慢性丙型肝炎患者HCV-RNA含量與CD4+C25+調(diào)節(jié)性T細胞的相關(guān)性研究［J］.臨床和實驗醫(yī)學(xué)雜志，2013，12(1):18-19.

［8］柳龍根，申紅玉，葉春艷，等.慢性丙型肝炎患者外周血CD4+CD25high調(diào)節(jié)性T細胞與抗病毒療效的關(guān)系［J］.上海交通大學(xué)學(xué)報:醫(yī)學(xué)版，2012，32(12):1610-1614.

［9］Yoshizawa K，Abe H，Kubo Y，et al.Expansion of CD4(+)CD25(+)FoxP3(+)regulatory T cells in hepatitis C virus-related chronic hepatitis，cirrhosis and hepatocellular carcinoma［J］.Hepatol Res，2010，40(2):179-187.

［10］Amoroso A，D’Amico F，Consolo M，et al.Evaluation of circulating CD4+CD25+and liver-infiltrating Foxp3+cells in HCV-associated liver disease［J］.Int J Mol Med，2012，29(6):983-988.

［11］Sakaguchi S，Sakaguchi N，Asano M，et al.Immunologic self-tolerance maintained by activated T cells expressing IL-2 receptor alpha-chains(CD25).Breakdown of a single mechanism of selftolerance causes various autoimmune diseases［J］.J Immunol，1995，155(3):1151-1164.

［12］Hori S，Nomura T，Sakaguchi S.Control of regulatory T cell development by the transcription factor Foxp3 ［J］.Science，2003，299(5609):1057-1061.