人Notch-1基因RNA干擾慢病毒載體的構(gòu)建及鑒定

張慶慶 張森林 朱迎蘭 董震 曹罡 陳偉

1.南方醫(yī)科大學南京臨床醫(yī)學院口腔科；2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院口腔科，南京 210002

涎腺腺樣囊性癌（salivary adenoid cystic carcinoma，SACC）是涎腺常見的惡性腫瘤，國內(nèi)統(tǒng)計其占涎腺腫瘤的9.9%[1]，國外統(tǒng)計其占涎腺腫瘤的7.5%[2]。SACC的惡性程度高，主要表現(xiàn)為侵襲性強，局部易復發(fā)；易遠處轉(zhuǎn)移，以肺轉(zhuǎn)移多見，轉(zhuǎn)移率高達40%；有典型嗜神經(jīng)性，早期即可沿神經(jīng)侵襲和轉(zhuǎn)移，導致面癱、麻木、疼痛等神經(jīng)受損癥狀，給臨床治療帶來很大的困難，預后差[2]。本課題前期研究已成功構(gòu)建了SACC嗜神經(jīng)侵襲基因表達譜，Notch-1即為其中重要差異表達基因之一[3]。

Notch信號途徑是一個進化上保守的信號轉(zhuǎn)導通路，在調(diào)節(jié)細胞的分化、增殖與凋亡中起重要作用。Notch信號途徑的異常調(diào)控可引起組織的發(fā)育異常，并最終導致腫瘤等多種疾病的發(fā)生[4]。研究[5]表明，Notch家族基因Notch-1、Notch-2、Notch-4與SACC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)，但其與SACC嗜神經(jīng)侵襲行為間的關(guān)系尚未見報道。本研究的目的是構(gòu)建人Notch-1基因的RNA干擾（RNA interference，RNAi）慢病毒載體，并對其進行鑒定，尋找最佳RNAi慢病毒載體，為探討Notch-1在SACC中的功能與分子機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要材料

慢病毒載體pLenOR-THM（上海英為信生物科技有限公司），配有3個包裝質(zhì)粒pRsv-REV、pMDlgpRRE、pMD2G。Taq DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、KpnⅠ（Takara公司，日本），T4 DNA連接酶（NEB北京有限公司），AxyPrep質(zhì)粒小量制備試劑盒（Axygen公司，美國），Nucleo-Bond Xtra Midi Plus質(zhì)粒純化試劑盒（Macherey-Nagel公司，德國），高效感受態(tài)細胞制備試劑盒（上海生物工程有限公司），大腸桿菌菌株DH5α、RPMI-1640和DMEM培養(yǎng)基、LipofectaminTM2000、胰蛋白酶、Trizol（Invitrogen公司，美國），M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶（Fermentas公司，加拿大），SYBR Master Mixture（Toyobo公司，日本），胎牛血清（PAA公司，美國）。兔抗人Notch-1、GAPDH抗體（Abcam公司，英國），HRP標記的山羊抗兔多抗、增強型化學發(fā)光檢測試劑盒（Pierce公司，美國）。包裝細胞293T細胞株、ACC-M細胞株購自中科院上海細胞所，寡核苷酸及引物均由上海生物工程有限公司合成。

1.2 靶向Notch-1基因的寡核苷酸設(shè)計

針對人Notch-1基因序列（GenBank：NM_004-557.3），按照RNAi序列設(shè)計原則[6-7]，設(shè)計RNAi靶點序列（shRNA1～3），同時設(shè)計一段陰性對照序列（NC），經(jīng)BLAST分析表明其均不與人任何其他cDNA序列同源。再根據(jù)以上4段序列分別設(shè)計合成4對寡核苷酸序列，每對包含一條正義鏈（sense）和一條反義鏈（antisense）（表1）。4對寡核苷酸序列退火后均可形成在5’端含BamHⅠ酶切位點，3’端含EcoRⅠ酶切位點，中間含21個堿基發(fā)夾環(huán)的小片段DNA雙鏈。

表1 針對人Notch-1基因序列設(shè)計的寡核苷酸對Tab 1 Oligonucleotide sequences of Notch-1 specific shRNAs

1.3 慢病毒載體pLenOR-THM-Notch-1的構(gòu)建、擴增及鑒定

將pLenOR-THM載體用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和EcoRⅠ行雙酶切，將酶切產(chǎn)物用低熔點瓊脂糖膠回收并和上述寡核苷酸退火后的產(chǎn)物混合，然后經(jīng)T4 DNA連接酶連接過夜，從而將Notch-1基因序列插入慢病毒載體pLenOR-THM，構(gòu)建pLenOR-THMNotch-1重組載體。連接后的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α細菌，經(jīng)含氨芐青霉素培養(yǎng)基篩選陽性克隆后，挑取單菌落擴大培養(yǎng)。按分子克隆實驗指南用堿裂解法手工抽提質(zhì)粒。由于靶RNA干擾序列插入位點是BamHⅠ和EcoRⅠ之間，酶切出的片段較小，不易于分辨，故設(shè)計重組載體中的KpnⅠ和EcoRⅠ位點，增大酶切出的片段長度，行雙酶切初步鑒定。使用Axygen試劑盒抽提質(zhì)粒并通過DNA測序（南京金斯瑞生物科技公司）進一步鑒定。

1.4 包裝產(chǎn)生siRNA的病毒顆粒及測定病毒滴度

重組質(zhì)粒載體pLenOR-THM-Notch1、包裝質(zhì)粒pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G分別進行去內(nèi)毒素中量質(zhì)粒抽提，并進行濃度測定，同時設(shè)置空載體pLenOR-THM為對照。用脂質(zhì)體LipofectaminTM2000包裹慢病毒四質(zhì)粒系統(tǒng)（pLenOR-THM-Notch4、pRsv-REV、pMDlg-pRRE、pMD2G）共轉(zhuǎn)染293T細胞進行病毒包裝。48～72 h后大量病毒產(chǎn)生，收取含病毒的培養(yǎng)液，并通過0.45 μm濾器過濾，4 ℃、12 000 g 離心20 min后棄上清，沉淀，即為Notch-1基因RNAi慢病毒載體，分裝后凍存于-80 ℃待用。將純化過的病毒倍比稀釋后（1、0.1、0.01 μL）感染293T細胞，48 h后在熒光顯微鏡下觀察熒光。取0.1 μL病毒感染293T細胞，流式細胞儀檢測陽性細胞比例，測定病毒滴度（TU·mL-1），即每毫升病毒原液含有具有感染能力的病毒顆粒的個數(shù)。以復感染系數(shù)（multiplicity ofinfection，MOI）為1時感染293T細胞，感染72 h后熒光顯微鏡下觀察綠色熒光。在100倍光鏡下，隨機選擇不重疊的10個視野，手工計數(shù)發(fā)綠色熒光細胞占總細胞的比例，計算感染效率。

1.5 定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（polymerase chain reac-tion，PCR）檢測Notch-1 mRNA的表達

慢病毒轉(zhuǎn)染48 h后，從6孔板中每組各收集細胞1×106個，采用Trizol一步法抽提總RNA，用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄反應，然后用ABI-7900型熒光定量PCR儀進行PCR擴增。Real-Time PCR引物：Notch-1正義鏈為5’-AGTACTGTACCGAGGATGTGGACG-3’； 反義鏈為5’-GAAGGAGGCCACACGGTCAT-3’；GAPDH正義鏈為5’-GGAGTCCACTGGCGTCTTC-3’；反義鏈為5’-GCTGATGATCTTGAGGCTGTTG-3’。反應體系為20 μL。反應參數(shù)：95 ℃預變性2 min，95 ℃變性15 s，58 ℃復性20 s，72 ℃延伸20 s，45個循環(huán)。ACC-M為陰性對照，空載體Notch-1 mRNA為空白對照。采用2-ΔΔCt法計算基因表達的相對比值。

1.6 Western blot檢測Notch-1蛋白表達

慢病毒轉(zhuǎn)染96 h后，6孔板中各組以預冷的PBS液洗3次，加入100 μL預冷的含蛋白酶抑制劑的蛋白抽提試劑，刮匙收集樣本，4 ℃下10 000 g離心2 min，取上清，以BCA法測定提取蛋白濃度。每個樣本取50 μg蛋白加入等體積2×SDS上樣緩沖液，使用煮沸變性后預制的7.5% SDS-PAGE電泳分離，100 V×1 h濕法轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜。轉(zhuǎn)載標本蛋白的硝酸纖維素膜浸入含5%脫脂奶粉的TTBS（20 mmol·L-1Tris-HCL，pH 7.4，150 mmol·L-1NaCl，0.1% Tween-20），室溫封閉1 h，加入一抗（兔抗人Notch-1、GAPDH抗體，1︰1 000） ，4 ℃振蕩孵育過夜，TTBS洗滌15 min×4次后，加入HRP標記的山羊抗兔二抗（1︰5 000），室溫孵育1 h，充分洗滌后，電化學發(fā)光（electro-chemiluminescence，ECL）法檢測標本膜上的信號，記錄結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統(tǒng)計學處理。所有的細胞實驗均重復3次，定量實驗結(jié)果以均數(shù)±標準差來表示，組間兩兩單因素方差分析（one-way）比較采用ANOVA檢驗，以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 慢病毒載體pLenOR-THM-Notch-1的鑒定

重組載體經(jīng)KpnⅠ及EcoRⅠ雙酶切后，陽性克隆條帶大小為395 bp，陰性克隆條帶大小為330 bp（圖1）。鑒定結(jié)果與預期相符，說明目的片段已正確插入pLenOR-THM慢病毒載體。

圖1 重組載體經(jīng)Kpn Ⅰ及EcoR Ⅰ雙酶切鑒定結(jié)果Fig 1 Validation results of recombinant vector by Kpn Ⅰ and EcoRⅠdouble-digestion

DNA測序結(jié)果顯示，構(gòu)建的3個慢病毒載體均含有所設(shè)計的目的片段，其序列與設(shè)計的靶向Notch-1寡核苷酸序列完全一致，進一步證實目的片段已正確插入pLenOR-THM慢病毒載體，重組慢病毒載體pLenOR-THM-Notch-1構(gòu)建成功（圖2）。

2.2 慢病毒包裝與病毒滴度測定

慢病毒載體四質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細胞48 h后，熒光顯微鏡下可觀察到293T細胞發(fā)出大量綠色熒光。不同數(shù)量慢病毒感染293T細胞48 h后，其發(fā)出的綠色熒光強度不同（圖3）。慢病毒pLenOR-THM-Notch1濃縮后的病毒滴度約為5.8×108TU·mL-1。以MOI為1時感染293T細胞，感染72 h后熒光顯微鏡下可觀察到綠色熒光，感染效率達到90%以上。

圖2 重組載體pLenOR-THM-Notch-1測序圖譜Fig 2 The sequencing atlas of recombinant vector pLenOR-THM-Notch-1

圖3 不同數(shù)量慢病毒感染293T細胞 熒光顯微鏡 × 100Fig 3 293T cells infected by different quantity of purified lentivirus fluorescence microscope×100

2.3 PCR檢測Notch-1 mRNA的表達

PCR檢測結(jié)果（圖4）表明，陽性對照組的Notch-1 mRNA表達水平與陰性對照組無統(tǒng)計學差異，pLenORNotch-1-shRNA1、2、3組的Notch-1 mRNA表達均低于對照組，其中pLenOR-Notch-1-shRNA1、3組降低最明顯。

2.4 Western blot檢測Notch-1蛋白的表達

Western blot檢測結(jié)果（圖5）表明，pLenORNotch-1-shRNA1、3組與陰性對照組及陽性對照組相比，Notch-1蛋白表達明顯受到抑制，其中pLenORNotch-1-shRNA3組受抑制程度最高；pLenOR-Notch-1-shRNA2組與對照組相比，Notch-1蛋白表達未受抑制。

圖4 PCR檢測各組Notch-1 mRNA水平Fig 4 Notch-1 mRNA levels of each group analyzed by PCR

圖5 Western blot檢測各組Notch-1蛋白表達水平Fig 5 Notch-1 protein levels of each group analyzed by Western blot

3 討論

Notch家族基因于1919年在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)，該基因的部分功能缺失會在果蠅翅膀的邊緣造成缺口（notch），Notch基因由此而得名。1991年，Notch-1在人類的T淋巴母細胞白血病中首先被鑒定出來，表明了Notch信號通路和腫瘤相關(guān)[8]。人類的很多腫瘤（如頭頸部腫瘤、子宮內(nèi)膜癌、腎癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌、惡性黑色素瘤等）、血液系統(tǒng)疾病（如霍奇金淋巴瘤、B淋巴細胞白血病等）及一些其他病變（如根尖囊腫）中均發(fā)現(xiàn)Notch基因及其配體的異常表達[9-13]。研究[14]表明，通過降低Notch基因的表達，可以抑制人鼻咽癌細胞系的體外增殖能力。Notch-1和Notch-4被認為是乳腺癌的預測因素及潛在的基因治療靶點[15-16]。組織芯片研究表明，Notch-1在胃癌、胰腺癌中的表達與腫瘤的分化程度、浸潤深度等明顯相關(guān)，這可能是因為Notch-1可促進核轉(zhuǎn)錄因子-κB的表達，而后者上調(diào)了基質(zhì)金屬蛋白酶-9及血管內(nèi)皮生長因子導致的浸潤[17-18]。研究[19-20]表明，Notch基因的過表達與口腔鱗狀細胞癌相關(guān)，Notch基因可以作為頭頸部鱗狀細胞癌癌前病變診斷的候選基因和治療的新靶基因。

Notch信號通路與SACC的關(guān)系尚不明確。學者[5]用限制片段差異顯示PCR技術(shù)構(gòu)建了ACC-M和ACC-2細胞株的差異基因表達譜，認為Notch家族基因Notch-1、2、4與SACC的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移有關(guān)。本課題前期研究中，結(jié)合激光俘獲顯微切割和人類全基因組芯片技術(shù)，首次成功構(gòu)建出SACC嗜神經(jīng)侵襲相關(guān)基因表達譜，并經(jīng)過聚類分析和基因功能分析發(fā)現(xiàn)，Notch基因在嗜神經(jīng)侵襲組中特異性高表達[3]，這與另外兩項SACC基因表達譜的研究結(jié)果[21-22]相符合。

RNAi的本質(zhì)是由發(fā)夾樣結(jié)構(gòu)的小干擾RNA（small interference RNA，siRNA）介導的與之同源的mRNA特異性降解，進而抑制相應基因表達的過程[23]。通過適當?shù)募夹g(shù)生產(chǎn)特異性的siRNA并使其有效地作用于靶基因的mRNA，就能達到使該基因“沉默”的目的。生成siRNA的方法有化學合成法、體外轉(zhuǎn)錄合成法、質(zhì)粒載體介導的細胞內(nèi)表達法和病毒載體介導的細胞內(nèi)表達法等。其中，慢病毒載體是在人類免疫缺陷病毒1基礎(chǔ)上改造而成的病毒載體系統(tǒng)，能高效地將目的基因?qū)雱游锖腿说脑毎蚣毎?，其介導的基因表達作用持續(xù)且穩(wěn)定，目的基因能整合到宿主細胞基因組中，并隨細胞基因組的分裂而分裂[24-25]。

本實驗成功地構(gòu)建了Notch-1基因RNAi慢病毒載體pLenOR-THM-Notch-1，并通過雙酶切及DNA測序加以鑒定；通過病毒包裝、收集和濃縮，得到高滴度慢病毒顆粒，經(jīng)測定濃縮后的病毒滴度約為5.8×108TU·mL-1；以MOI為1時感染293T細胞后，感染效率達90%以上。結(jié)合QRT-PCR和Western blot檢測結(jié)果，pLenOR-Notch-1-shRNA3對Notch-1基因在mRNA及蛋白水平的抑制作用最為明顯。慢病毒載體pLenOR-THM-Notch-1的成功構(gòu)建為探討Notch-1基因在SACC中的生物學功能奠定了實驗基礎(chǔ)。

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