舌癌原代細(xì)胞化療藥物的體外敏感性觀察

白大兵 沈 軍 靳敏巧 安韡 高興明

(天津醫(yī)科大學(xué) 天津 300350;①天津市口腔醫(yī)院;②天津河北鐵三院醫(yī)院;③天津市海河醫(yī)院)

△作者工作單位:天津市海河醫(yī)院。

舌癌是口腔頜面部常見的惡性腫瘤。由于其位置特殊，病程發(fā)展較快，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移率較高。目前，綜合治療取得了較好的效果。但術(shù)前新輔助化療常由于個體差異等因素的存在，導(dǎo)致患者對藥物耐藥或產(chǎn)生較嚴(yán)重的不良反應(yīng)造成的治療效果下降，甚至阻礙進(jìn)一步治療。因此，個體化化療在臨床腫瘤化療中顯得尤為重要，腫瘤藥敏實(shí)驗(yàn)是實(shí)現(xiàn)腫瘤個體化化療的基礎(chǔ)［1］。本研究通過比較Tca83舌癌細(xì)胞株與裸鼠動物模型的原代舌癌細(xì)胞的化療藥物敏感實(shí)驗(yàn)，證實(shí)舌癌原代腫瘤細(xì)胞藥物敏感性實(shí)驗(yàn)的可行性與穩(wěn)定性，從而探討實(shí)施個體化化療。

1 對象與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對象 Tca83細(xì)胞系(北京大學(xué)口腔醫(yī)院提供)。裸鼠舌癌動物模型所獲的原代舌癌細(xì)胞(本課題組前期實(shí)驗(yàn)建立的裸鼠舌癌正位模型獲得)。

1.2 主要藥物及試劑 二甲基亞砜(DMSO)(美國 Sigma公司)。MTT(美國Sigma公司)。平陽霉素(天津太河制藥有限公司)。紫杉醇(哈爾濱三聯(lián)藥業(yè)有限公司)。順鉑(云南生物谷燈盞花藥業(yè)有限公司)。表阿霉素［輝瑞制藥(無錫)有限公司］。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)。復(fù)蘇Tca83細(xì)胞系，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106/mL(A)。裸鼠舌癌組織塊PBS沖洗并浸泡20min，減碎至大小約1mm3，置于胰蛋白酶(2mg/mL)中消化40min，200目濾網(wǎng)過濾，離心(1000r/min，5min)，棄上清，PBS漂洗，加入 RPMI-1640(含10%胎牛血清)調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至1×106/mL(B)。

1.3.2 MTT法。96孔培養(yǎng)板內(nèi)各孔分別加入A、B細(xì)胞懸液各200μl，分組后，每組4個復(fù)孔。將細(xì)胞放入37℃，5%CO2濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。將平陽霉素(PYM)、順鉑(CDDP)、紫杉醇(PTX)、表阿霉素按濃度梯度分為1ng/mL、10ng/mL、25ng/mL、100ng/mL、5μg/mL。每孔加入20μL藥液，加入同體積 RPIM-1640培養(yǎng)液培養(yǎng)48h。棄上清，每孔加入MTT試劑15μL再培養(yǎng)4h。棄上清，每孔加入150μL二甲基亞砜(DMSO)微震蕩5min。自動酶標(biāo)讀數(shù)儀上測出各孔波長570nm OD值。計(jì)算每一藥物不同濃度的抑制率，公式:抑制率=(1-測試孔平均OD值/對照孔平均OD值)×100%

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件處理，采用配對t檢驗(yàn)和χ2分析，P＜0.05則表示差異有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡觀察 加藥后48h，對照組細(xì)胞處于對數(shù)生長期，細(xì)胞貼壁生長，貼壁率為90%。細(xì)胞大多為多邊形，細(xì)胞連接緊密，折光性強(qiáng)。觀察組4種藥物對舌癌細(xì)胞均顯示出不同程度的生長抑制作用。在抗腫瘤藥物作用過程中，細(xì)胞首先出現(xiàn)膨脹現(xiàn)象，隨藥物濃度的提升及作用時(shí)間的增加，48h后可見50%的細(xì)胞胞體破裂、崩解、壞死等現(xiàn)象，其中表阿霉素效果尤為明顯。

2.2 藥物敏感性比較 在平陽霉素觀察組中，藥物濃度在50ng/mL時(shí)2種細(xì)胞均可出現(xiàn)變化。Tca83細(xì)胞系在藥物濃度為5μ g/mL時(shí)抑制作用明顯，從動物模型所取的原代細(xì)胞對藥物的敏感性更高;藥物濃度為25ng/mL時(shí)細(xì)胞便可出現(xiàn)抑制生長的變化。但高濃度藥物對細(xì)胞的殺傷作用小于腫瘤細(xì)胞系。Tca83細(xì)胞系的IC50(50%細(xì)胞生長抑制時(shí)的藥物濃度)為2.58μg/mL，原代細(xì)胞的IC50為4.5μg/mL。紫杉醇對腫瘤細(xì)胞系的抑制作用:藥物濃度為1ng/mL時(shí)，腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)明顯的生長抑制，＞25ng/mL時(shí)，細(xì)胞死亡速度加快，細(xì)胞形態(tài)開始改變，胞核變大，細(xì)胞膜模糊不清，最終細(xì)胞陸續(xù)漂浮、死亡。藥物對腫瘤模型中的原代細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用的最小濃度為10ng/mL。細(xì)胞系的IC50為1.22μg/mL;原代細(xì)胞的IC50為 2.2μg/mL。順鉑對腫瘤細(xì)胞系產(chǎn)生的作用:Tca83細(xì)胞的最小抑制濃度為25ng/mL，藥物濃度增大到100ng/mL時(shí)可見細(xì)胞由膨脹改為皺縮，細(xì)胞膜邊界不淸，崩解加快、逐漸死亡。與腫瘤原代細(xì)胞相比，后者藥物敏感性稍低。在藥物濃度為5μg/mL時(shí)可見細(xì)胞大量死亡。細(xì)胞系的IC50為1.56μg/mL;原代細(xì)胞的IC50為2.4μg/mL。表阿霉素在藥物濃度為25ng/mL時(shí)出現(xiàn)對腫瘤細(xì)胞系的抑制作用;對原代細(xì)胞抑制作用出現(xiàn)在濃度為100ng/mL時(shí)，細(xì)胞系的IC50為1.79μg/mL，原代細(xì)胞的IC50為3.36μg/mL。2種細(xì)胞對4種藥物的敏感性順序相同，從高到低依次為紫杉醇＞順鉑＞表阿霉素＞平陽霉素，對各類藥物的敏感性差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，見表1。

表1 兩種腫瘤細(xì)胞IC50時(shí)各藥物濃度μg/mL

2.3 藥物對2種腫瘤細(xì)胞的抑制程度比較 見圖1，圖2。

圖1 Tca83細(xì)胞藥敏試驗(yàn)結(jié)果A

圖2 裸鼠舌癌原代細(xì)胞藥敏試驗(yàn)結(jié)果B

3 討論

舌癌作為口腔癌的常見病，在我國口腔頜面部惡性腫瘤中的發(fā)病率已達(dá)到32.3%，其中中老年患者舌癌容易出現(xiàn)轉(zhuǎn)移。由于舌部組織血管和淋巴管豐富，使該部位惡性腫瘤增加了早期頸部淋巴管和遠(yuǎn)處淋巴管轉(zhuǎn)移的可能，預(yù)后往往較差，在目前公認(rèn)的術(shù)前誘導(dǎo)化療+手術(shù)治療+術(shù)后放療的綜合治療手段中，化療屬全身性治療，目前認(rèn)為腫瘤新輔助化療具有以下優(yōu)點(diǎn)［2～4］:①縮小原發(fā)灶，減少切除范圍，進(jìn)一步保存功能或?qū)υl(fā)灶過大而無手術(shù)指征的患者創(chuàng)造手術(shù)機(jī)會;②控制和消滅衛(wèi)星灶和轉(zhuǎn)移灶［5］;③獲得腫瘤的體內(nèi)藥敏資料，為術(shù)后選擇輔助化療方案提供依據(jù);④早期化療可以防止遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，可提高患者的生存率和治愈率;⑤腫瘤對化療藥物的反應(yīng)可作為評估病人預(yù)后的指標(biāo)之一。

Kirita T［6］等的研究表明舌癌行術(shù)前輔助化療可以降低腫瘤細(xì)胞的生存率，殘余的腫瘤細(xì)胞多集中在腫塊的表層，可以縮小進(jìn)展性舌癌的手術(shù)范圍，有利于保護(hù)其形態(tài)及功能。無論是術(shù)前誘導(dǎo)化療還是術(shù)后輔助化療，研究化療藥物對舌癌的敏感性都顯得至關(guān)重要。

從本研究結(jié)果中可看出，二者對藥物作用的總體趨勢是相同的，同時(shí)所得結(jié)果與MTT法檢測所得結(jié)果基本一致，這一現(xiàn)象說明Tca83細(xì)胞在體外經(jīng)培養(yǎng)及接種成瘤后，對藥物的敏感性未發(fā)生明顯改變。體外敏感性檢測的研究也較多。陳建文等［7］應(yīng)用此法研究腦膠質(zhì)瘤時(shí)發(fā)現(xiàn)客觀有效率及疾病控制率在藥敏試驗(yàn)敏感組顯著高于耐藥組。蔣芹等［8］在對食管癌的研究后，報(bào)道了聯(lián)合用藥者的化療總體敏感度高于單一用藥者。體外藥敏試驗(yàn)是實(shí)現(xiàn)個體化化療的有效途徑之一［10］。

體外藥敏試驗(yàn)對藥物進(jìn)行初步篩選和敏感度的預(yù)測，尤其是為臨床患者設(shè)計(jì)合理的個體化治療方案，避免無效藥物所致的不良反應(yīng)，在提高治療效果方面具有重要的價(jià)值［9］。

在檢測結(jié)果中我們發(fā)現(xiàn)，二者對藥物的敏感性雖趨勢相同，但原代細(xì)胞的IC50明顯高于腫瘤細(xì)胞系。考慮原因?yàn)?①腫瘤異質(zhì)性較強(qiáng)，即使是同一種腫瘤不同的部位對藥物的敏感性也有可能不同。②MTT法實(shí)施過程中正常細(xì)胞污染腫瘤細(xì)胞，測定的0D值會受到影響，降低測定結(jié)果的穩(wěn)定性。③2種癌細(xì)胞在分離過程中受機(jī)械損傷不同，修復(fù)能力下降不同［8］。

本實(shí)驗(yàn)通過原代細(xì)胞體外藥敏試驗(yàn)，可以明確化療藥物對原代細(xì)胞的敏感性，對于臨床選擇更針對性的個體化化療具有一定的提示作用。但是本實(shí)驗(yàn)仍存在問題，就是細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)間是不是較長，會影響患者的最佳治療時(shí)機(jī)的選擇。這需要后續(xù)實(shí)驗(yàn)需要解決的問題，以期能為臨床提供合適的個性化治療。

［1］倪 煒，羅 林，左 頻，等.體外藥物敏感實(shí)驗(yàn)為依據(jù)的惡性腦膠質(zhì)瘤個體化化療初步研究［J］.現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2012，12(6):1075

［2］楊 凱，季 平，李雅冬，等.時(shí)辰動脈灌注化療在口腔鱗癌新輔助化療中的臨床應(yīng)用研究［J］.臨床口腔醫(yī)學(xué)雜志，2006，22(1):23

［3］于吉人.胃癌新輔助化療的研究進(jìn)展［J］.實(shí)用腫瘤雜志，2010，25(5):594

［4］TADAAKI KIRITA，DDS，DMSc，et al.prognostic Value of response to preoperative chemoradiotherapy and residuaLtumor grades in tongue carcinoma［J］.OraLSurg OraLMed OraLPathoL0raLRadioLEndod，2001，91:293

［5］邱蔚六.口腔頜面外科理論與實(shí)踐［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，585-592

［6］KIRITA T，OHGI K，KAWAKAMI M，et al.Primary tumour resection of tongue carcinoma based on response to preoperative therapy［J］.Int J OraLMaxillofac Surg，2002，31(3):267

［7］陳建文，張俊平，程金建，等.體外藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)的惡性腦膠質(zhì)瘤預(yù)見性化療［J］.廣東醫(yī)學(xué)，2005，26(9):1183

［8］蔣 芹，匡久樹，黃小明，等.MTT法體外檢測癌細(xì)胞藥敏試驗(yàn)及臨床相關(guān)性研究［J］.實(shí)用癌癥雜志，2001，16(1):57

［9］蘇祖祿，蘇 海，張 毅，等.腦膠質(zhì)瘤化療藥物的體外敏感性試驗(yàn)研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，35(13):1420

［10］毛德強(qiáng)，潘玲，戴勤弼，等.體外組織塊培養(yǎng)藥敏試驗(yàn)指導(dǎo)下腦膠質(zhì)瘤化療的臨床療效分析［J］.Chinese GeneralPractice，2011，14(10B):3390