不同提取方法對(duì)杜香熊果酸提取得率的影響

張喬會(huì)，逄錦慧，楊 喆，董施彬，寧亞萍，王建中，*

(1．北京林業(yè)大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林業(yè)食品加工與安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083;2．北京林業(yè)大學(xué)材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，林木生物質(zhì)化學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100083)

杜香(Ledum palustre L．)為杜鵑花科杜香屬的常綠灌木［1］，是我國(guó)東北、內(nèi)蒙古大興安嶺林區(qū)的主要森林組成樹(shù)種，其分布面積約占大興安嶺林地面積的70%［2］。大興安嶺杜香干葉年生產(chǎn)量達(dá) 536925t·a-1［3］，小興安嶺杜香的蘊(yùn)藏量可達(dá) 8776．7t·hm-2·a-1，其中允收量以鮮重計(jì)為 1843．2t·hm-2·a-1［3］。杜香枝葉含有多種揮發(fā)性成分、熊果酸、多糖等成分［4-7］。

熊果酸具有抗炎［8］、鎮(zhèn)靜、增強(qiáng)機(jī)體免疫力、保肝［9-10］、抗癌、抗腫瘤［11-16］、美白、抗菌等藥理作用。能溶于醇，不溶于水、石油醚等，其提取采用乙醇熱提法、甲醇滲漉法、超臨界提取、回流提取法，并輔助超聲波、微波提取等。醇提一般輔以一定的溫度，雜質(zhì)較多;超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解;微波輔助提取是利用微波能來(lái)提高萃取率的新發(fā)展起來(lái)的技術(shù);閃式提取是在高剪切力的作用下破壞物料的物理結(jié)構(gòu)從而溶出其中物質(zhì)。各種方法各有優(yōu)點(diǎn)也各有不足，同時(shí)閃式提取杜香熊果酸鮮有報(bào)道，杜香資源大，開(kāi)發(fā)利用杜香熊果酸價(jià)值高，研究不同方法提取杜香熊果酸對(duì)其利用具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

杜香 由內(nèi)蒙古金河林業(yè)局2013年7月中旬采集提供，由北京林業(yè)大學(xué)植物專(zhuān)家堅(jiān)定為杜香;無(wú)水乙醇(AR)、石油醚(AR)、香草醛(AR)、冰醋酸(AR)、高氯酸(AR)、去離子水、活性碳、熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品 HPLC≥98%，中國(guó)食品藥品檢定研究所。

HHS4型恒溫水浴鍋 上海浦東躍新科學(xué)儀器廠(chǎng);KQ-500E型超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;QI-901渦旋混合器 海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司;臺(tái)式離心機(jī) 上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng);RE-5203旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀 上海亞榮生化儀器廠(chǎng);METTLER TOLEDO電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;冷凍干燥機(jī)FD-1 北京德天佑科技發(fā)展有限公司;JHBE-50S閃式提取控制器 鄭州金星科技有限公司;T6紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司;Tensor27型FT-IR紅外光譜儀 德國(guó)Bruker公司;S-3400N掃描電子顯微鏡 日本日立公司;E-1010濺射鍍膜機(jī) 日本日立公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1．2．1 試樣的制備 將杜香枝葉切分成2～3cm的小段后于40℃烘箱中烘干，然后用BL-05粉碎機(jī)粉碎，80目過(guò)篩，將過(guò)篩后的粉末按1∶5加入石油醚脫脂脫色12h，過(guò)濾除去石油醚并將粉末放入40℃烘箱中烘干，然后存于室內(nèi)陰涼干燥處備用。

1．2．2 杜香中熊果酸的提取工藝 采用90%的乙醇液提取，回收溶劑并用石油醚和水除雜，用活性碳脫色，并置于冷凍干機(jī)中干燥。

1．2．3 杜香熊果酸的定性檢測(cè) 準(zhǔn)確稱(chēng)取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg及提取樣品置容量瓶中，用無(wú)水乙醇溶解并定容到100mL，以乙醇作為對(duì)照液。利用紫外光譜對(duì)杜香醇提熊果酸及熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紫外可見(jiàn)光譜掃描，掃描范圍為200～800nm，掃描速度快，掃描次數(shù)為3。利用Tensor27型FT-IR紅外光譜儀對(duì)杜香醇提熊果酸及熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行紅外測(cè)定，紅外測(cè)定范圍為400～4000cm-1，分辨率為2cm-1。并對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品和樣品的光譜結(jié)果進(jìn)行比對(duì)鑒定。

1．2．4 熊果酸粗提物得率計(jì)算 按以下公式計(jì)算提取得率:

式中:P-熊果酸粗提物提取得率;m-提取得到的杜香熊果酸的干重;W-杜香粉末的重量。

1．2．5 粗提物中熊果酸含量的測(cè)定 樣品中含量的測(cè)定采用分光光度法，參考溫媛媛方法進(jìn)行測(cè)定［17］。

1．2．5．1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制 精密稱(chēng)取105℃干燥至恒重的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品10mg，用無(wú)水乙醇定容至100mL的容量瓶中，即得0．1mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。分別精密吸取熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0．5、0．6、0．7、0．8、0．9、1．0mL 置試管中，加熱揮去溶劑，加 5% 香草醛- 冰醋酸 0．2mL，高氯酸 0．8mL，60℃ 水浴加熱15min，取出冷卻后移至10mL容量瓶中，加冰醋酸稀釋至刻度，搖勻后在548nm處測(cè)定吸光度，同時(shí)以試劑空白作為參比。

1．2．5．2 樣品中熊果酸含量的測(cè)定 準(zhǔn)確稱(chēng)取不同方法提取所得樣品10mg，用無(wú)水乙醇定容至100mL的容量瓶中，即得0．1mg/mL的熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液。取0．8mL置試管中，加熱揮去溶劑，加5%香草醛-冰醋酸 0．2mL，高氯酸 0．8mL，60℃ 水浴加熱 15min，取出冷卻后移至10mL容量瓶中，加冰醋酸稀釋至刻度，搖勻后以試劑空白作為參比在548nm處測(cè)定吸光度，并計(jì)算出熊果酸含量。

1．2．6 杜香中熊果酸提取工藝的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 設(shè)計(jì)不同的提取方法，具體為超聲波提取30min、室溫浸提24h、閃式提取1min、閃式提取2min、閃式提取3min、閃式提取4min，考察不同方法對(duì)杜香中熊果酸提取得率的影響。

1．2．6．1 超聲波提取 設(shè)定料液比 1∶20，提取溫度為室溫，提取時(shí)間30min，物料粒度分別為80目，用超聲波輔助提取，超聲波功率為440W。

1．2．6．2 室溫浸提 設(shè)定料液比 1∶20，提取溫度為室溫，提取時(shí)間24h，物料粒度分別為80目，輔以輕微的震蕩。

1．2．6．3 閃式提取 設(shè)定料液比 1∶20，提取溫度為室溫，物料粒度分別為80目，提取時(shí)間分別為1、2、3、4min，使用閃式提取器進(jìn)行輔助提取。

1．2．7 提取后料渣的電鏡掃描 在掃描電子顯微鏡(SEM)設(shè)備下觀察提取后的料渣的表面形態(tài)，掃描電鏡采用10千伏的加速電壓，檢測(cè)前，使用濺射鍍膜機(jī)對(duì)材料表面進(jìn)行噴金。

1．2．8 數(shù)據(jù)處理 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用 Microsoft excel 2007進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜香熊果酸的紫外及紅外檢測(cè)結(jié)果

從熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品及杜香熊果酸提取樣品的紫外波長(zhǎng)掃描譜圖來(lái)看，兩者都在204nm處有最大吸收峰，且整個(gè)紫外-可見(jiàn)波長(zhǎng)范圍內(nèi)只有204nm處的一個(gè)峰，符合熊果酸的紫外特征吸收，證明提取物中含有熊果酸。

圖1 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的紫外掃描譜圖Fig．1 UV scanning spectrum of Ursolic Acid standard

圖2 熊果酸樣品的紫外掃描譜圖Fig．2 UV scanning spectrum of Ursolic Acid sample

從圖 3可以看出，熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品在 3526．78、2959．40、1717．94、1454．61、1385．57、1244．77cm-1等處都有明顯有吸收峰，為熊果酸中-OH、-C=O、-C-H、-CH3等基團(tuán)的振動(dòng)。從圖4可以看出，從杜香中提取的熊果酸樣品的紅外譜圖在 3522．78、2951．39、1721．86、1446．43、1385．34、1244．36cm-1等處也均有峰，與熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的特征峰基本一致，說(shuō)明提取物中含有熊果酸。

圖3 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)品的紅外光譜圖Fig．3 IR spectrum of Ursolic Acid standard

圖4 熊果酸樣品的紅外光譜圖Fig．4 IR spectrum of Ursolic Acid sample

2.2 不同方法提取杜香中熊果酸實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．2．1 提取得率 從圖5可以看出，3min內(nèi)，隨著閃式提取時(shí)間的增加，提取得率增大，之后隨時(shí)間的增加提取得率不再變化。超聲波輔助提取的得率高于室溫浸提24h，但低于閃式提取2min以上的提取得率。總體來(lái)說(shuō)，閃式提取得率(提取2min以上)＞超聲波輔助提取30min＞室溫浸提24h。

圖5 不同提取方法的提取得率Fig．5 Extraction rate of different extraction technologies

2．2．2 提取過(guò)程中溫度的變化 從表1可以看出，超聲波輔助提和閃式提取器輔助提取都會(huì)明顯導(dǎo)致提取溫度的變化，且在1～3min內(nèi)，隨著閃式提取時(shí)間增加，溫度呈線(xiàn)性上升。超聲波在傳播過(guò)程中，聲能可以不斷被介質(zhì)所吸收，吸收的能量幾乎全部轉(zhuǎn)變?yōu)闊崮?，從而?dǎo)致介質(zhì)本身和待萃取成分溫度升高，增大了有效成分的溶解度這種吸收聲能引起植物組織內(nèi)部溫度的升高是瞬時(shí)的，因此可使被提取成分的生物活性保持不變;而閃式提取產(chǎn)生的溫度變化可能是由于閃式提取刀頭的高速轉(zhuǎn)動(dòng)和物料的摩擦產(chǎn)生機(jī)械摩擦，從而將機(jī)械能轉(zhuǎn)化為熱能，所以隨著閃式提取時(shí)間的增加，溫度也隨著增加，但當(dāng)溫度達(dá)到一定水平后，由于產(chǎn)生的熱量和周?chē)諝猱a(chǎn)生熱交換，使提取溫度不再上升。

表1 不同方法提取后物料的溫度變化Table 1 Change of the material’s temperture after extract by different methods

2．2．3 提取粗產(chǎn)物的比較結(jié)果 從表2可以看出，超聲波輔助提取及室溫提取的粗產(chǎn)物顏色明顯要淺，且呈粉末狀態(tài);用閃式提取器輔助提取的粗產(chǎn)物顏色深，呈膠黏狀。因而可以推斷出用閃式提取器輔助提取可能因?yàn)樘崛∫汉?5%的水，且閃式提取刀頭摩擦產(chǎn)熱導(dǎo)致局部溫度快速升高，從而導(dǎo)致杜香粉末中的多糖及其他組分溶出，使得粗產(chǎn)物黏性增加、顏色加深。超聲波輔助提取的粗產(chǎn)物由于受超聲的影響，也溶出一些其他組分，但瞬時(shí)升溫對(duì)多糖的溶出影響不大。

表2 不同提取方法粗提物的顏色及狀態(tài)Table 2 Color and form of the impure extracting by different extraction technologies

2．2．4 不同方法得到樣品中熊果酸含量測(cè)定結(jié)果 從圖6可知，熊果酸濃度在5～10μg/mL范圍內(nèi)呈良好線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為 y=0．0732x-0．1264，相關(guān)系數(shù) R2=0．9991。

圖6 熊果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig．6 The standard curve of ursolic acid

從表3可以看出，不同方法提取得到的熊果酸樣品中熊果酸的含量略有差異，但差異不大。其中含量最高的是用超聲波輔助提取得到的樣品，其次是室溫提取得到的樣品。閃式提取得到的樣品中熊果酸的含量隨著閃式提取時(shí)間的增加而逐漸降低，這與閃式提取得到的樣品顏色較深、雜質(zhì)較多相匹配。但含量降低的程度很小，可能是增加的熊果酸的提取率，但也增加雜質(zhì)的提取率，使得樣品中熊果酸的含量有一定的降低。

表3 不同提取方法粗提物的中熊果酸含量Table 3 The content of ursolic acid by different extraction technologies

2.3 提取后杜香粉末的掃描電鏡結(jié)果

圖7 原料的掃描電鏡圖(500×)Fig．7 Scanning picture of original medicinal meterials by SEM(500×)

2．3．1 500倍放大結(jié)果 從圖7～圖13可以看出，放大500倍時(shí)，24h浸泡、超聲波提取30min與未處理的幾個(gè)樣品沒(méi)有明顯的區(qū)別。但閃式提取后的樣品就能看出明顯的差別，與前幾個(gè)樣品比較，經(jīng)過(guò)閃式提取后的樣品顆粒度明顯比其他處理的要細(xì)，且隨著閃式提取時(shí)間的加長(zhǎng)，顆粒度變細(xì)的程度也逐漸增大。

圖8 室溫提取24h料渣的掃描電鏡圖(500×)Fig．8 Scanning picture of extraction in room temperature for 24 h by SEM(500×)

圖9 超聲波輔助提取30min的掃描電鏡圖(500×)Fig．9 Scanning picture of extraction for 30 minutes by ultrasonic assisted by SEM(500×)

圖10 閃式提取1min的掃描電鏡圖(500×)Fig．10 Scanning picture of flash extraction for 1 minutes by SEM(500×)

2．3．2 3000倍放大結(jié)果 從圖14～圖20可以看出，沒(méi)有經(jīng)過(guò)處理的粉末表面比較光滑，沒(méi)有碎裂，也沒(méi)有過(guò)多的孔洞。而室溫浸泡24h的粉末及閃式提取1min的物料表面出現(xiàn)了很多的孔洞，可能是由于粉末中的物質(zhì)溶解后留下的空隙;電鏡圖片顯示杜香原料表面可見(jiàn)很多粒狀附著物，可能是淀粉、蔗糖等。超聲波處理的粉末放大后可明顯看到結(jié)構(gòu)受到破壞，其中很大部分都碎裂并分離。而經(jīng)過(guò)閃式提取處理的樣品則主要表現(xiàn)在表面結(jié)構(gòu)被機(jī)械破碎，粉末的表面一層受到了很大的機(jī)械破壞，且隨著閃式時(shí)間的加長(zhǎng)，破碎的程度加大。

圖11 閃式提取2 min的掃描電鏡圖(500×)Fig．11 Scanning picture of flash extractionfor 2 minutes by SEM(500×)

2.4 電鏡與提取得率綜合分析結(jié)果

結(jié)合提取后物料的電鏡掃描照片及不同方法提取的得率進(jìn)行分析，可以看出，就提取熊果酸得率而言，幾種方法中最優(yōu)的是閃式提取，其次是微波輔助提取，最后是室溫提取24h，而閃式提取的時(shí)間設(shè)3min即可。但從粗提物的顏色及狀態(tài)來(lái)判斷，閃式提取的雜質(zhì)最多，室溫長(zhǎng)時(shí)間提取次之，超聲波輔助提取雜質(zhì)最少?？赡苁且?yàn)殚W式提取除擠壓和剪切作用外，還產(chǎn)生許多次級(jí)效應(yīng)，如渦旋擴(kuò)散、粉碎、化學(xué)效應(yīng)等也都有利于使植物中有效成分向溶劑轉(zhuǎn)移，并充分和溶劑混合，促進(jìn)提取的進(jìn)行;閃提時(shí)間在3min內(nèi)對(duì)提取呈正相關(guān)，但超過(guò)3min后，由于物料已經(jīng)被擠壓破碎得很細(xì)，加上升高溫度及二級(jí)作用使得物質(zhì)已經(jīng)全部溶解到溶劑中而使提取得率不再上升。室溫長(zhǎng)時(shí)間提取可能是因?yàn)槲镔|(zhì)在溶劑中經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的擴(kuò)散，逐步轉(zhuǎn)移到溶劑中;而超聲法，空化產(chǎn)生的極大壓力造成被破碎物細(xì)胞壁及整個(gè)生物體破裂，而且整個(gè)破裂過(guò)程在瞬間完成。同時(shí)超聲波產(chǎn)生的振動(dòng)作用加強(qiáng)了胞內(nèi)物質(zhì)的釋放、擴(kuò)散及溶解，加速植物中的有效成分進(jìn)入溶劑［18］。

圖14 原料的掃描電鏡圖(3000×)Fig．14 Scanning picture of original medicinal meterials by SEM(3000×)

圖15 室溫提取24h的掃描電鏡圖(3000×)Fig．15 Scanning picture of extractionin room temperature for 24 h by SEM(3000×)

圖16 超聲波提取30 min的掃描電鏡圖(3000×)Fig．16 Scanning picture of extraction for 30 minutes by ultrasonic assisted by SEM(3000×)

圖17 閃式提取1min的掃描電鏡圖(3000×)Fig．17 Scanning picture of flash extraction for 1minutes by SEM(3000×)

圖18 閃式提取2 min的掃描電鏡圖(3000×)Fig．18 Scanning picture of flash extraction for 2 minutes by SEM(3000×)

圖19 閃式提取3 min的掃描電鏡圖(3000×)Fig．19 Scanning picture of flash extraction for 3 minutes by SEM(3000×)

圖20 閃式提取4 min的掃描電鏡圖(3000×)Fig．20 Scanning picture of flash extraction for 4 minutes by SEM(3000×)

3 結(jié)論

綜合以上分析可知，閃式提取及超聲波輔助提取都對(duì)物料造成較大的機(jī)械破壞使得提取得率增加，閃式提取法以機(jī)械擠壓摩擦造成機(jī)械破碎，而超聲波以機(jī)械空化及振動(dòng)使物料造成機(jī)械破碎。物料機(jī)械破碎的程度越大，提取得率越高，同時(shí)雜質(zhì)越多。為追求熊果酸最大提取得率，較優(yōu)方法為閃式提取3min，提取得率為1．18%，但閃式提取雜質(zhì)較多，超聲波輔助提取雜質(zhì)相對(duì)較少，如考慮簡(jiǎn)化純化步驟，較優(yōu)方法為超聲波輔助提取，提取得率為0．83%。結(jié)合資源、能源及提取得率等分析，較優(yōu)提取方法為閃式提取3min。當(dāng)然，具體提取參數(shù)還有待進(jìn)一步研究分析。

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