大豆酯酶的篩選及對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)效果的研究

邵佳甲

（長春職業(yè)技術(shù)學(xué)院，吉林 長春130118）

目前，全球范圍內(nèi)農(nóng)藥污染廣泛，人們對(duì)農(nóng)藥殘留的檢測(cè)技術(shù)提出了更高要求，需要快速、可靠、靈敏的農(nóng)藥檢測(cè)技術(shù)來進(jìn)行日常監(jiān)測(cè)。在眾多快速檢測(cè)方法之中，應(yīng)用最為廣泛的為以乙酰膽堿酯酶做酶源做成的試紙條進(jìn)行檢測(cè)。但乙酰膽堿酯酶屬于動(dòng)物酯酶，動(dòng)物酯酶不容易取材，且保存困難[1]，同時(shí)價(jià)格昂貴。然而植物酯酶與動(dòng)物酯酶存在相似的敏感性[2]，并且取材廣泛，價(jià)格低廉，且保存期較長，有較高的研究價(jià)值。[3]

本文選擇大豆作為研究對(duì)象，大豆與其他品種相比酯酶含量較高。[4]但不同品種的大豆酯酶含量不同，因此本文篩選出酯酶含量較高的品種并建立了大豆酯酶和8 種有機(jī)磷農(nóng)藥的線性關(guān)系，確定了最低檢測(cè)限。

一、材料與方法

1.供試材料

大豆：26 種大豆購自于吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)種子中心。

主要試劑：市售樂果農(nóng)藥，市售敵百蟲農(nóng)藥，市售敵敵畏農(nóng)藥，市售氧樂果農(nóng)藥，市售久效磷農(nóng)藥，市售甲胺磷農(nóng)藥，市售二嗪磷農(nóng)藥，市售對(duì)硫磷農(nóng)藥。

試劑：無水乙醇（分析純），磷酸二氫鈉，a－乙酸萘酯，磷酸氫二鈉，固藍(lán)B 鹽。

儀器：722分光光度計(jì)（上海奧普博儀器有限公司）；磁力攪拌器（金壇市富華儀器有限公司）；離心機(jī)（Sigma公司）；恒溫水?。ū本﹪A醫(yī)療器械廠）；多功能粉碎機(jī)（天津市泰斯特有限公司）。

2.試驗(yàn)方法

（1）制備大豆酯酶：把大豆用多功能粉碎機(jī)粉碎碎，用0.3 mol L 1 pH=7.0 的磷酸緩沖液作提取液，取粉碎后的大豆粉浸泡在磷酸緩沖液中，按質(zhì)量比1∶5 進(jìn)行混合，用磁力攪拌器進(jìn)行30min 攪拌提取，放置4℃冰箱中提取12 小時(shí)，然后將溶液離心10min（5000r/min），取上清液便是大豆酯酶粗酶液。[5]

（2）底物溶液的制備：把100mg a 乙酸萘酯溶解于無水乙醇80mL 中。

（3）制備顯色試劑：取100mL 蒸餾水，將25mg 固藍(lán)B 鹽溶于其中。

（4）大豆酯酶含量的測(cè)定：在各試管里分別加入制備好的酶液0.1ml，以及pH值為7.5的磷酸緩沖液1.9mL，底物0.1mL，振蕩混勻，然后將試管放置在30℃恒溫水浴鍋中保溫10min，10min 后馬上取出，將0.9mL 顯色劑添加溶液定容至10mL，將此溶液放置在30℃水浴鍋中，進(jìn)行保溫10min，然后在722 分光光度計(jì)下于520nm進(jìn)行測(cè)定。

（5）抑制方程的建立：配制濃度分別為100mg／L、10mg／L、5mg／L、lmg／L、0．5mg／L、0．1mg／L、0．05mg／L、0．01mg／L、0．001mg／L 的有機(jī)磷農(nóng)藥。同時(shí)替換步驟1.2.4 中的磷酸緩沖液，將緩沖液換為不同濃度的農(nóng)藥，然后按（4）的步驟測(cè)定吸光值。

（6）對(duì)不同農(nóng)藥檢測(cè)限的確定：以儀器可以檢測(cè)到的最小農(nóng)藥濃度作為大豆酯酶對(duì)農(nóng)藥的最低檢測(cè)限。

二、結(jié)果與分析

1.比較不同品種大豆酯酶的吸光值

選取26 種吉林省常見大豆品種按以上步驟處理，測(cè)定相應(yīng)的吸光值，吸光值越大，酶活性越高。[6]吸光度比較見表1。對(duì)表1 中數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得出不同品種大豆總酯酶含量也不相同。

表1 不同品種大豆酯酶的吸光值比較

適合農(nóng)藥檢測(cè)的，總酯酶含量較高的品種為：通農(nóng)10、吉林36，長農(nóng)16，吉農(nóng)14，吉農(nóng)6，吉農(nóng)16 等。對(duì)于這些品種可以對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步研究。不適合進(jìn)行農(nóng)藥檢測(cè)的品種，總酯酶含量則較低的分別是：吉豐1，吉林35，吉林50，吉林78 等。根據(jù)以上數(shù)據(jù)選擇通農(nóng)10 進(jìn)行有機(jī)磷類農(nóng)藥檢測(cè)使用，從而進(jìn)一步研究有機(jī)磷類農(nóng)藥和大豆酯酶之間的作用關(guān)系。

2.不同濃度農(nóng)藥對(duì)大豆酯酶的抑制效果比較

將敵敵畏、敵百蟲、甲胺磷、二嗪磷、對(duì)硫磷、毒死蜱、辛硫磷分別稀釋至以下幾種濃度100mg/L，10 mg/L，5 mg/L，1 mg/L，0.5 mg/L，0.1 mg/L，0.05 mg/L，0.01 mg/L.

然后按照上面所敘述方法進(jìn)行吸光值測(cè)定，通過計(jì)算數(shù)據(jù)計(jì)算農(nóng)藥對(duì)酶的抑制率，制作有機(jī)磷農(nóng)藥濃度對(duì)數(shù)與抑制率之間的對(duì)數(shù)曲線（如圖1），對(duì)數(shù)方程的斜率能反映出大豆酯酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的靈敏度。

對(duì)圖表進(jìn)行分析得出，大豆酯酶對(duì)不同農(nóng)藥的靈敏度不同，靈敏度高低依次為久效磷，甲胺磷，對(duì)硫磷、敵敵畏、敵百蟲、二嗪磷、氧樂果，其中毒死蜱的靈敏度最差。

圖1 不同農(nóng)藥的抑制曲線

3.有機(jī)磷農(nóng)藥的抑制反應(yīng)方程和檢測(cè)限

抑制率I=A 未抑制 A 抑制/A 未抑制×100%

以抑制率I 為X 軸，抑制劑濃度的對(duì)數(shù)值為Y 軸，可以用數(shù)值方法擬合出一條抑制率與農(nóng)藥濃度對(duì)數(shù)值的抑制方程。從方程中我們能更加直觀地分析出幾種農(nóng)藥和大豆酯酶之間的抑制關(guān)系，而抑制曲線的斜率有效地展示了有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)所用大豆酯酶的抑制程度[7]，斜率越大對(duì)大豆酯酶的抑制率越強(qiáng)，靈敏度越高。

農(nóng)藥曲線方程相關(guān)系數(shù)最低檢測(cè)限（ppm）Pesticideequationscoefficient correlationlimit of detection：

久效磷y=22.505x+37.595R2=0.9860.05 Monocrotophos，甲胺磷y=20.181x+35.644R2=0.9940.05Acephatemet，對(duì)硫磷 y = 16.389x + 28.478R2 = 0.99440.05Parathion，敵敵畏 y = 11.527x + 56.412R2 =0.99050.05Panaplate，敵百蟲y=9.760x+37.384R2=0.98010.05Trichlorphon，二嗪磷y=9.4009x+20.107R2=0.99150.05Diazinon，氧樂果y=3.3331x+24.153R2=0.98280.1Omethoate，毒死蜱y=2.5026x+17.196R2=0.98120.1Durshan。

表2 有機(jī)磷農(nóng)藥酶抑制反應(yīng)方程

對(duì)表2 進(jìn)行分析，能更好地確定大豆酯酶和各農(nóng)藥靈敏度的關(guān)系，具體檢測(cè)靈敏度由強(qiáng)到弱順序?yàn)椋壕眯Я祝炯装妨祝緦?duì)硫磷＞敵敵畏＞敵百蟲＞二嗪磷＞氧樂果＞毒死蜱。

大豆酯酶對(duì)8 種有機(jī)磷類農(nóng)藥的最低檢測(cè)限試驗(yàn)結(jié)果見表2，對(duì)久效磷甲胺磷、對(duì)硫磷、敵敵畏、敵百蟲、二嗪磷的最低檢測(cè)限為0.05ppm，而氧樂果和毒死蜱分別為0.1 ppm?？梢妼?duì)此8 種農(nóng)藥的最低檢測(cè)限均低于有機(jī)磷農(nóng)藥殘留檢測(cè)的最低限值要求。因此大豆酯酶可以作為有機(jī)磷農(nóng)藥快速檢測(cè)的一種手段。

三、結(jié)論

1.通過對(duì)26 種大豆種子中的總酯酶含量的比較，篩選出通農(nóng)10、吉林36，長農(nóng)16，吉農(nóng)14，吉農(nóng)6，吉農(nóng)16 等作為有機(jī)磷類農(nóng)藥殘留檢測(cè)的適宜酶源，可以在有機(jī)磷農(nóng)藥檢測(cè)方面應(yīng)用。

2.大豆酯酶對(duì)有機(jī)磷類農(nóng)藥有較好的靈敏性，最低檢測(cè)線能夠達(dá)到檢測(cè)要求，適宜在農(nóng)藥檢測(cè)方面應(yīng)用。

3.本試驗(yàn)研究了有機(jī)磷農(nóng)藥—大豆酯酶的作用關(guān)系，確定了相關(guān)的曲線特征及8 個(gè)酶抑制方程，表明了大豆酯酶對(duì)市場(chǎng)上常用的8 種農(nóng)藥有較好的靈敏性，為用酶抑制法進(jìn)行有機(jī)磷農(nóng)藥的殘留分析提供了參考。

4.大豆酯酶檢測(cè)方法具有操作方便、快速、靈敏、廉價(jià)以及適于非專業(yè)人員現(xiàn)場(chǎng)快速測(cè)定的優(yōu)點(diǎn)，更適應(yīng)市場(chǎng)的需要。

[1]周艷麗，李建科，溫艷霞.用于農(nóng)藥檢測(cè)的大豆酯酶的純化分離[J].大豆科學(xué)，2007，（6）.

[2]韓承輝，谷巍，王乃巖，等.快速測(cè)定水中有機(jī)磷農(nóng)藥方法的研究[J].環(huán)境化學(xué)，2000，19（2）：187.

[3]張寧.兩種酶快速檢測(cè)有機(jī)磷農(nóng)藥殘留條件優(yōu)化研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2006，（1）：135-137.

[4]溫艷霞，李建科.有機(jī)磷農(nóng)殘檢測(cè)用植物酯酶的研究[J].食品科學(xué)，2006，27（4）：123-125.

[5]Baker J E，F(xiàn)abrick J A，Zhu K Y.Characterization of esterases in malathion—resistant and susceptible strains of the pteromalid parasitoid anisopteromalus calandrae[J]．Insect Biochemistry and Molecular Biology，1998，28：l039-l050．

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[7]阮長青，楊娟，賈偉.有機(jī)磷農(nóng)藥與小麥酯酶作用關(guān)系研究[J].黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，18（1）：61-62.