鮮滸苔稀硫酸水解產糖工藝研究

馮大偉 , 姜 鵬, 李富超, 秦 松 趙 瑾, 陳華新

(1.海岸帶生物學與生物資源利用重點實驗室 中國科學院 煙臺海岸帶研究所 山東煙臺 264003; 2.實驗海洋生物學重點實驗室 中國科學院 海洋研究所 山東青島 266071)

滸苔屬大型綠藻, 在我國南、北方海區(qū)均有分布[1]。滸苔兼具有性、無性及營養(yǎng)繁殖等多種繁殖方式[2],日生長率可達12.7%[3], 有些種類還可漂浮生長并大量聚集, 短期內形成可觀的生物量[4-5], 是一種亟待開發(fā)的資源生物。盡管滸苔可作為食品、飼料、肥料和藥物開發(fā)的原料[6], 但應用仍非常有限, 缺乏大規(guī)模資源化利用的新途徑。

目前, 生物質產燃料乙醇研究主要是以農業(yè)廢棄物為原料, 如玉米芯[7]、甘蔗渣、小麥與稻米秸稈和木屑等[8]。以大型海藻作為生物質產燃料乙醇的嘗試仍非常有限, 僅見Horn等[9]以北方海帶Laminaria hyperborea的提取物——褐藻淀粉和甘露醇為原料進行乙醇發(fā)酵, 每克提取物最高可產生0.43 g乙醇,其褐藻淀粉與甘露醇的提取工藝和酒精發(fā)酵工藝仍有待進一步優(yōu)化。由于滸苔藻體柔軟, 由單層細胞構成, 較陸地生物質更易于被酸、堿和酶消化, 且滸苔生物量可觀, 干基含有 50%以上的多糖和 10%左右的纖維素[10-12], 具有發(fā)酵產燃料乙醇的潛力, 作為能源生物開發(fā)將為滸苔的資源利用開辟新途徑。

生物質糖化是產燃料乙醇的關鍵工藝, 常見的生物質糖化方法有酸法、酶法, 以及先用酸預處理,再用酶解生物質等方法[13-17]。本文對利用滸苔進行稀硫酸水解及纖維素酶酶解進行了比較研究, 確定了本文實驗條件下滸苔糖化的最佳工藝, 為進一步的燃料乙醇發(fā)酵研究提供了參考。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2008年6 月自青島第一海水浴場采集岸邊擱淺堆積的新鮮漂浮滸苔。

1.2 測定滸苔總糖含量

使用改進的硫酸兩步水解法測定滸苔總糖含量[18]。將新鮮滸苔清洗除去鹽分、泥沙和雜藻, 于105℃恒溫干燥 4 h至恒重, 為了使?jié)G苔能被硫酸充分水解,用液氮充分研磨成細微粉末, 然后再次105℃恒溫干燥4 h至恒重, 稱取上述滸苔樣品200 mg轉入試管,加入2 mL 72%的硫酸, 30℃水解60 min, 之后將水解液完全轉移至可密封的聚四氟乙烯罐中, 并加入51.1 mL蒸餾水將硫酸濃度稀釋至4%, 高壓滅菌鍋中121℃反應60 min, 水解液8 000 r/min離心5 min,上清液用 3, 5-二硝基水楊酸(DNS)比色法測定還原糖含量(測3個平行樣品)[19], 滸苔總糖含量計算公式如下:

式中,ES——滸苔總糖含量;C——滸苔水解液還原糖濃度;m——反應體系中滸苔質量; 53.1——水解液總體積; 0.9——換算系數[16]。

1.3 滸苔稀硫酸水解工藝

將新鮮滸苔清洗除去鹽分、泥沙和雜藻, 加入適量蒸餾水后用高速組織粉碎機徹底打碎, 過濾擠壓除去水分, 4℃冷藏備用。稱取適量新鮮滸苔(干質量1.0 g)置于50 mL的聚四氟乙烯消化罐中, 加19 mL蒸餾水使?jié)G苔干物質含量為 5%, 再加入濃硫酸, 設置硫酸梯度終濃度分別為0.6%、1.0%、1.4%、1.8%、2.2%, 消化罐加蓋密封后于高壓滅菌鍋中 121℃分別處理30、60、90 min, 將反應液過濾、8 000 r/min離心5 min, DNS比色法測定上清液中還原糖含量(測兩個平行樣品), 滸苔固體殘留物用蒸餾水沖洗至pH中性(用pH試紙測量pH為7.0)并分別收集。

1.4 纖維素酶水解

將每個沖洗至 pH中性(用 pH試紙測量 pH為7.0)的滸苔稀硫酸水解殘留物樣品分別與30 mL檸檬酸鈉緩沖液(pH = 4.6)混合于 150 mL三角瓶中,加入5 mg纖維素酶(酶活力>30 000 U/g), 恒溫搖床中 45℃酶解 48 h, 搖床轉速為 120 r/min, 酶解后8 000 r/min離心5min, 上清液用DNS比色法測定還原糖含量。

2 結果

DNS比色法測定滸苔總糖含量為 67.2%。滸苔經不同濃度稀硫酸水解不同反應時間后的還原糖產量(mg/g, 干滸苔)、滸苔稀硫酸水解殘留物經酶解后還原糖產量以及二者數值相加的還原糖總產量見表1。滸苔經不同濃度稀硫酸水解不同反應時間的還原糖轉化率(還原糖轉化率(%)= 還原糖產量 × 0.9 ×100/(1000 × 滸苔總糖含量))見圖1, 公式中0.9為換算系數[16]。滸苔稀硫酸水解殘留物經酶解后還原糖轉化率見圖2。

表1 滸苔經不同濃度稀硫酸水解不同反應時間后的還原糖產量、滸苔稀硫酸水解殘留物經酶解后還原糖產量以及還原糖總產量Tab.1 Release of reducing sugars from fresh U.prolifera (after dilute sulfuric acid hydrolysis; after enzymatic hydrolysis; reducing sugars of the two steps)

3 討論

DNS比色法測定滸苔總糖含量高達 67.2%, 進行燃料乙醇發(fā)酵開發(fā)具有較好前景。稀硫酸水解和纖維素酶酶解是主要的生物質糖化工藝, 稀硫酸水解能夠得到一部分還原糖, 并破壞剩余多糖的結構, 從而有利于后續(xù)的纖維素酶酶解進一步釋放還原糖[16]。

圖1 滸苔經稀硫酸水解后的還原糖轉化率Fig.1 Conversion rate of reducing sugars after dilute sulfuric acid hydrolysis of fresh U.prolifera

圖2 滸苔稀硫酸水解殘留物經酶解后的還原糖轉化率Fig.2 Conversion rate of reducing sugars after enzymatic hydrolysis of fresh U.prolifera residues obtained with dilute sulfuric acid hydrolysis

在121℃高溫高壓條件下, 用不同濃度的稀硫酸經不同反應時間水解滸苔, 對滸苔水解殘留物再進行過量纖維素酶酶解。如圖1所示, 單獨的稀硫酸水解工藝即可得到很高的滸苔還原糖轉化率。隨著反應時間的增加, 不同濃度的稀硫酸條件下還原糖產量均明顯增加, 但還原糖產量增加幅度隨稀硫酸反應時間的增加而減小, 并最終停止增長, 這是由于部分還原糖在高溫高壓條件下會轉變成糠醛等副產物[14,16]。在硫酸質量分數為1.8%、反應時間為90 min條件下, 還原糖轉化率可達59.9%, 此時每克干質量滸苔可產生447.0 mg還原糖(表1), 此條件可以作為滸苔稀硫酸水解工藝的最佳條件。

如圖2所示, 稀硫酸水解殘留物的纖維素酶酶解工藝中, 滸苔還原糖轉化率很低, 在硫酸質量分數為0.6%、水解時間為60 min的時候還原糖轉化率出現最大值, 僅為 6.5%, 此時每克干質量滸苔只產生了48.8 mg還原糖(表1)。隨稀硫酸濃度提高, 殘留物經纖維素酶酶解產生的還原糖反而減少, 表明單獨的稀硫酸水解工藝釋放還原糖已較為充分。另外, 滸苔多糖中纖維素含量較低可能也是造成酶解釋放還原糖效果較差的原因[6]。麥秸干基中含有70%以上的纖維素, 在硫酸質量分數為1.5%、反應90 min條件下每克干物質可產生約330 mg還原糖, 酸處理后經纖維素酶酶解最多可再產生197.1 mg還原糖[16],滸苔與麥秸相比在稀硫酸水解階段產還原糖較多,但后續(xù)酶解處理產糖量很少, 這種差異提示建立海藻原料的糖化工藝應充分考慮海藻自身的生化組成特點。

滸苔稀硫酸水解產還原糖效果顯著, 而后續(xù)纖維素酶酶解的補充釋放效果不夠理想, 提示滸苔糖化工藝可單獨采用稀硫酸水解, 這樣可大大降低生產成本。在建立滸苔糖化工藝的基礎上, 可進一步對滸苔進行酒精發(fā)酵, 生產燃料乙醇。同樣的稀硫酸水解工藝條件下, 本文中的新鮮滸苔原料和后續(xù)研究中曬干之后貯存兩個月以上的滸苔原料得到的水解產糖結果存在明顯差異, 這提示了滸苔原料的新鮮程度對滸苔的酸解產糖也有較大影響, 在滸苔的曬干和貯存過程中, 自然界存在的白腐菌[20]、其他微生物對滸苔的分解消化作用以及滸苔自身的物理化學變化可能是造成這種差異的原因。滸苔多糖中含有鼠李糖、葡萄糖、木糖、半乳糖、甘露糖和糖醛酸等單糖[21], 后續(xù)研究中將具體研究滸苔稀硫酸水解工藝中各個單糖的產量和變化, 為滸苔燃料乙醇發(fā)酵提供更為細致的理論指導。

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