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    磁共振血管造影在磷酸二酯酶4D基因多態(tài)性與缺血性腦卒中相關(guān)性研究中的應(yīng)用

    2014-12-15 16:57汪瑞霞楊佳張哲林
    中國醫(yī)藥導(dǎo)報 2014年31期
    關(guān)鍵詞:條帶多態(tài)性基因型

    汪瑞霞++楊佳++張哲林

    [摘要] 目的 探討磷酸二酯酶4D(PDE4D)基因多態(tài)性與缺血性腦卒中(IS)患者磁共振血管造影(MRA)結(jié)果的相關(guān)性。 方法 應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)方法檢測245例IS患者和208例正常對照組PDE 4D基因SNP83及SNP87酶切多態(tài)性。同時開展MRA檢查結(jié)果與PDE 4D基因SNP83及SNP87多態(tài)性相關(guān)性分析。 結(jié)果 245例IS患者中,77.78%患者MRA結(jié)果異常,其中,顱外血管(ECMRA)異常占53.37%,顱內(nèi)(ICMRA)異常占65.80%,兩者兼有占41.97%。腦卒中患者的PDE 4D基因SNP 83的CC基因型頻率較正常對照組高(OR為3.57,95%CI 1.39~6.52,P < 0.01);與ICMRA結(jié)果正常的患者相比較,ICMRA結(jié)果異常的腦卒中患者的PDE 4D基因SNP 87的TT基因型頻率增高(OR為0.57,95%CI 0.01~0.43,P = 0.01)。PDE 4D基因SNP 83的基因型及等位基因頻率與MRA異常結(jié)果無顯著相關(guān)(P > 0.05)。 結(jié)論 PDE 4D基因SNP 87多態(tài)性與MRA結(jié)果異常相關(guān)。PDE 4D基因SNP 83與IS相關(guān),與MRA結(jié)果異常無顯著性相關(guān)。

    [關(guān)鍵詞] 磷酸二酯酶 4D基因多態(tài)性;缺血性腦卒中;磁共振血管造影

    [中圖分類號] R743.1 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-7210(2014)11(a)-0018-05

    Phosphodiesterase 4D gene polymorphism correlation with MRA findings in patients with ischemic stroke

    WANG Ruixia YANG Jia ZHANG Zhelin

    Department of Neumlogy, the Affiliated Hospital of Inner Mongolia Medical University, Inner Mongolia Autonomous Region, Huhhot 010050, China

    [Abstract] Objective To investigate the correlation between phosphodiesterase 4D (PDE 4D) gene polymorphism and MRA findings in patients with ischemic stroke (IS). Methods Three polymorphisms SNP 83 and SNP 87 in PDE 4D gene were analyzed in 245 patients of IS and 208 controls using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism method in a case-control study. Meantime to carry out the polymorphisms SNP 83 and SNP 87 in PDE 4D gene correlation with MRA findings in patients with ischemic stroke. Results Among the 245 patients, MRA was abnormal in 77.78% patients; extracranial MRA (ECMRA) in 55.37%, intracranial MRA (ICMRA) in 65.80% and both were abnormal in 41.97% patients. The frequency of CC genotype of PDE4D83 was significantly higher in the patients with ischemic stroke compared to controls (OR = 3.57, 95%CI 1.39-6.52, P < 0.01). The frequency of TT genotype of PDE4D87 was significantly higher in ICMRA abnormalities compared to normal ICMRA (OR = 0.57, 95%CI 0.01-0.43, P = 0.01). The genotype and allele frequency of PDE4D83 was not significantly related to MRA abnormalities (P > 0.05). Conclusion The PDE 4D gene SNP 87 polymorphism is associated with MRA abnormalities, but SNP 83 is associated with IS and not significantly related to MRA abnormalities.

    [Key words] Phosphodiesterase 4D gene polymorphism; Ischemic stroke; Magnetic resonance angiography

    缺血性腦卒中(ischemic stroke,IS)是由多種遺傳與環(huán)境因素共同作用導(dǎo)致的一類極其復(fù)雜的神經(jīng)系統(tǒng)疾病,其主要是由顱外動脈血管(頸動脈及脊椎基底動脈)或者顱內(nèi)動脈血管動脈粥樣硬化造成的[1-2]。研究表明,無癥狀的動脈粥樣硬化的斑塊、微栓子脫落可反復(fù)出現(xiàn)短暫性腦缺血發(fā)作癥狀,一旦斑塊破裂、出血,就可突然發(fā)生腦卒中。同時在高血壓癥狀的影響下,血脂較高者顱內(nèi)小動脈也易發(fā)生粥樣硬化,斑塊形成,血管腔狹窄。當血壓升高或降低時易誘發(fā)血栓形成導(dǎo)致腦梗死[3-5]。目前常常采用磁共振血管造影(magnetic resonance angiography,MRA)對頸動脈粥樣硬化引發(fā)的腦卒中進行無創(chuàng)性檢查[6]。其可同時觀察兩側(cè)頸部和顱內(nèi)動脈,是臨床醫(yī)師選擇治療方案的重要依據(jù)。

    磷酸二酯酶(Phosphodiesterase,PDE)是一類催化水解cAMP和cGMP,使其轉(zhuǎn)變?yōu)槭セ钚缘膯魏塑账岬年P(guān)鍵酶,是cAMP和cGMP水解的唯一途徑[7]。PDE的活性是調(diào)控細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的強度和持續(xù)時間的重要因素。至今已鑒定出PDE有11個家族,共30余種。PDE4D是PDE中的大家族,是保持cAMP穩(wěn)態(tài)的重要調(diào)節(jié)者,是炎癥和免疫細胞的主要PDE同工酶,是PDE家族中最大的一群,其有四個亞型(PDE4A、4B、4C、4D),各種亞型又有多種次亞型[8]。PDE4D在體內(nèi)廣泛表達,主要分布于各種炎癥細胞內(nèi),包括肥大細胞、巨噬細胞、嗜酸粒細胞、淋巴細胞和上皮細胞等。PDE4D為cAMP特異性PDE,其作用為水解細胞內(nèi)cAMP水平,而后者是一種有多種生物學作用的分子,其作用之一是影響血管細胞的增殖和移行。因此,PDE4D可能通過其水平和活性的變化影響細胞內(nèi)cAMP水平,進而可能參與動脈粥樣硬化進程[9]。為此,本研究選取Gretarsdottir等[10]于2003年首次證實PDE4D基因單核苷酸多態(tài)性與IS相關(guān)的研究中關(guān)聯(lián)顯著的2個位點,即SNP 83、SNP 87展開研究,探討PDE4D基因多態(tài)性與IS患者MRA結(jié)果的相關(guān)性。

    1 資料與方法

    1.1 一般資料

    病例組:選取2010年10月~2012年11月間內(nèi)蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院(以下簡稱“我院”)神經(jīng)內(nèi)科住院的經(jīng)MRI檢查診斷為IS患者245例,男135例,女110例;年齡40~87歲,平均(62.88±8.75)歲。進一步對IS患者顱外(頸動脈及脊椎基底動脈)及顱內(nèi)動脈血管開展MRA檢查,將其分為MRA結(jié)果異常與MRA結(jié)果正常兩組?;颊唛g均無親屬關(guān)系。無腦卒中病史的對照組:選取同時期我院體檢中心健康體檢者,共計208例,男118例,女90例;年齡43~85歲,平均(61.21±7.56)歲。均行神經(jīng)查體、頭顱MRI/A及血管超聲檢查,排除既往卒中、TIA、血管狹窄等癥狀?;颊唛g均無親屬關(guān)系。

    入選標準:病例組患者經(jīng)MRI/A檢查,證實顱內(nèi)、外動脈存在狹窄≥50%或閉塞;存在與病變側(cè)血管供應(yīng)區(qū)明顯相關(guān)的臨床癥狀與體征特點;符合國際疾病分類第9版(ICD 9)的IS診斷標準,均屬于急性卒中治療試驗(TOAST)中的動脈血管粥樣硬化引起的IS。

    排除標準:存在與腦卒中相關(guān)的心源性栓塞及主動脈夾層、大動脈炎、心肌梗死、甲狀腺功能紊亂、腦靜脈竇血栓癥等患者。

    腦卒中的臨床風險因素:包括高血壓[收縮壓 ≥140 mm Hg及舒張壓≥90 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa),高血病史及藥物治療情況]、糖尿?。崭寡恰?06 mg/dL,餐后2 h血糖≥200 mg/dL及藥物治療情況)、血脂異常情況(血脂指標、冠狀動脈疾?。?、腦卒中病史、吸煙及飲酒情況。

    所有研究對象均于研究課題開始前,簽署知情同意書。

    1.2 方法

    1.2.1 臨床資料收集及MRA檢查 抽取受試對象空腹血液標本,全自動生化分析儀進行血常規(guī)、血糖、血脂、肝腎功能等項目檢測,并且詳細詢問病史及臨床相關(guān)危險因素。MRA檢查內(nèi)容如下:受試對象1周之內(nèi)采用1.5 T磁共振掃描器對顱內(nèi)及顱外動脈血管造影檢查。掃描序列采用較厚3D層塊容積(顱內(nèi)動脈3層塊,顱外6層塊),26 ms脈沖重復(fù)時間(TR)、6.9 ms回波時間(TE)和20°反轉(zhuǎn)角(FA)。由課題組外的資深神經(jīng)系統(tǒng)放射專家,依據(jù)MRA最大信號強度投影計算血管狹窄程度,若血管狹窄程度﹤50%,即認為血管病變程度沒有臨床意義;若血管狹窄程度≥50%即認為MRA結(jié)果異常,臨床上有重要意義;若血管狹窄程度為50%~<80%,認為中等程度狹窄;若血管狹窄程度為80%~<90%,認為嚴重狹窄;若血管狹窄程度為90%~100%,認為完全閉塞。

    1.2.2 基因多態(tài)性分析 基因組DNA采用血液基因組柱式小量提取試劑盒(0.1~1.0 mL)(北京康為世紀生物科技有限公司)提取。SNP83位點序列上游引物:5′-TTGTTTCTAGTTAGCCTTG-3′;下游引物:5′-ATTTGGCCTTGCAATATAC-3′;SNP87位點序列上游引物:5′-AAGATGAGGAAGAATAATCC-3′;下游引物:5′-ATGAAGACACCTGAAAGATC-3′。PCR擴增體系25 μL(Mastermix 12.5 μL;模板DNA 250 ng;上下游引物各1.0 μL,不足體積用無酶水補足)。PCR擴增條件:95℃5 min;95℃ 30 s,62℃ 30 s,72℃ 30 s,41個循環(huán);72℃延伸5 min。取5 μL擴增產(chǎn)物進行酶切(酶切體系15 μL)。內(nèi)切酶分別為TaiⅠ(New England Biolabs)及SSP1(New England Biolabs)限制性內(nèi)切酶。酶切產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳,于凝腔圖像分析系統(tǒng)下分析基因型。

    1.2.3 酶切結(jié)果判定 SNP83缺乏相應(yīng)酶切位點為T/T型純合子(359 bp,1條帶),存在相應(yīng)酶切位點為C/C型純合子(264 bp、95 bp,2條帶),若為C/T雜合子型(359 bp、264 bp、95 bp,3條帶);SNP87缺乏相應(yīng)酶切位點為T/T型純合子(264 bp、222 bp,2條帶),存在相應(yīng)酶切位點為C/C型純合子(486 bp,1條帶),若為C/T雜合子型(486 bp、264 bp、222 bp,3條帶)。

    1.3 統(tǒng)計學方法

    采用SPSS 13.00統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析,計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示,兩組間比較采用t檢驗;等位基因計數(shù)采用直接計數(shù)法,并計算基因型頻率,不同基因型及等位基因分布頻率比較采用χ2檢驗,多因素分析采用Logistic回歸。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

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