一種診斷用谷氨酸脫氫酶酶學性質研究

杜振元

遼寧省朝陽市第二醫(yī)院檢驗科，遼寧朝陽 122000

診斷原料用酶的性質是決定酶法試劑質量的關鍵，因此對臨床診斷用酶的酶學性質進行研究具有重要意義[1]。谷氨酸脫氫酶(Glutamate dehydrogenase,GLDH)是生物體代謝途徑中一種重要的酶類，谷氨酸脫氫酶可分為NAD 依賴型（EC1.4.1.2）、NAD（P）依賴型（EC1.4.1.3）及NADP 依賴型（EC 1.4.1.4）。酶法尿素氮試劑用到的谷氨酸脫氫酶是NAD 依賴型（EC1.4.1.2），該種谷氨酸脫氫酶一般不太穩(wěn)定，只有在硫酸銨溶液中才不容易失活[2-3]。谷氨酸脫氫酶可以用于多種生化診斷試劑的配制，谷氨酸脫氫酶是配制尿素氮試劑盒(速率法)所需兩種酶之一，尿素氮的含量反應蛋白的分解代謝和腎臟功能[4]。此外，谷氨酸脫氫酶還可用于血氨試劑盒和K 離子試劑盒測定等[5-6]。國內有文獻對谷氨酸脫氫酶的酶學性質進行過報道[7]，但是沒有說明酶的出處。該文對一種國產谷氨酸脫氫酶的酶學進行研究，證明該種谷氨酸脫氫酶酶學性質符合酶法尿素氮試劑盒的原料用酶要求。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

谷氨酸脫氫酶由北京邁迪卡科技有限公司生產；NADH 和α-酮戊二酸購于Sigma 公司，Tris 和NH4Cl 是國產生化分析純試劑；檢測儀器是Olympus AU400 全自動生化分析儀器和島津2450 紫外可見分光光度計。

1.2 實驗方法

1.2.1 谷氨酸脫氫酶活力的測定 該法以α-酮戊二酸、銨離子及還原型輔酶I（NADH）為底物，在谷氨酸脫氫酶催化作用下，轉變?yōu)楣劝彼岷脱趸洼o酶I（NAD），利用NADH 在340 nm 處有吸收峰，監(jiān)測其反應速率（-△A/min），計算谷氨酸脫氫酶的活力單位。反應混合液的pH 為8.3，含有0.1 mol/L 的Tris-Cl、0.2 mol/L的氯化銨、0.01 mol/L 的α-酮戊二酸和一定量的酶液。所有酶活測定，如果未作特殊說明，反應體系溫度均為37 ℃。

1.2.2 谷氨酸脫氫酶米氏常數的測定 采用Linewaeaver―Burk作圖法（雙倒數作圖法）對谷氨酸脫氫酶的米氏常數進行測定。所有酶活測定，如果未作特殊說明，反應體系溫度均為37℃。

2 結果

2.1 谷氨酸脫氫酶pH 穩(wěn)定性的測定

將一定量的谷氨酸脫氫酶稀釋至pH 為4～12 的緩沖液中，25 ℃條件下放置20 h。其中，pH 4～6 為醋酸緩沖液，pH 6～8 范圍為磷酸鹽緩沖體系；pH 8～10 為Tris-Cl 緩沖體系，pH10～12 為甘氨酸緩沖體系。然后37 ℃條件下測定殘存谷氨酸脫氫酶的活力。實驗表明該種谷氨酸脫氫酶具有pH 作用范圍廣的優(yōu)點，在pH 為5～10 范圍內穩(wěn)定性較好，酶殘存活力在90%以上。見圖1。

圖1 谷氨酸脫氫酶pH 穩(wěn)定性

2.2 谷氨酸脫氫酶最適反應溫度的測定

溫度是影響酶作用的重要因素。酶反應的速度隨溫度的變化而變化。通常溫度每增加10 ℃，酶反應速度增加1～2倍。在一定條件下，每種酶都有一個最適宜的作用溫度，在最適溫度下酶的活力最高，作用效果最好。為了測定谷氨酸脫氫酶的活力，取一定量的谷氨酸脫氫酶稀釋至pH 為8.3 的0.1mol/L 的Tris-Cl緩沖液中，然后在島津2450 紫外分光光度計上將反應溫度分別調整至30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃條件，試劑保溫1 min，然后加入稀釋好的谷氨酸脫氫酶測定活力。實驗表明該種谷氨酸脫氫酶的最適反應溫度是45 ℃。見圖2。

圖2 谷氨酸脫氫酶最適反應溫度的測定

2.3 谷氨酸脫氫酶最適pH 的測定

酶在一定的較狹的pH值范圍內表現出最高活力，這個pH值就是酶作用的最適pH值。高于或低于這一pH值，酶的穩(wěn)定性下降，活性受到影響。為了測定谷氨酸脫氫酶的最適pH，配制如下種類緩沖液：pH 范圍為6～7.5 的0.1 M 磷酸鉀緩沖液；pH范圍為6～7.5 的0.1 M Tris-HCL 緩沖液；pH 范圍為8.5～10.5 的0.1 M 甘氨酸緩沖液。以上3種緩沖液中含有0.1 mol/L 的氯化銨、0.01 mol/L 的α-酮戊二酸和7.5 mmol/L 的NADH。取一定量的谷氨酸脫氫酶稀釋至pH 為8.3 的0.1 mol/L 的Tris-Cl 緩沖液中。然后37 ℃條件下測定谷氨酸脫氫酶在不同pH條件下的活力。實驗結果表明谷氨酸脫氫酶最適pH值是7.5，實驗結果見圖3。

圖3 谷氨酸脫氫酶最適pH 的測定

2.4 谷氨酸脫氫酶Km值的測定

米氏常數（Km）是酶的特征性常數，Km 只與酶的種類、反應體系的pH 和反應溫度有關系，而與酶的濃度和底物的濃度無關。酶的米氏常數越大，說明需要的底物濃度越高，所以酶的Km數值是反應酶性質優(yōu)略的重要指標。筆者利用Lineweaver－Burk作圖法對谷氨酸脫氫酶催化正反應的3個底物（NN4、α-酮戊二酸、NADH）的米氏常數（3），根據直線在橫軸上的截距（1/Km），求得米氏常數Km。實驗表明，麥迪卡公司產谷氨酸脫氫酶的米氏常數與進口知名品牌相比相差不大，見表1。

表1 谷氨酸脫氫酶各種底物的米氏常數（mol/L）

3 討論

診斷試劑原料用酶屬于酶制劑行業(yè)的一個小分支，與工業(yè)用酶不同，生化診斷試劑用原料酶理化性質要求較高。一種好的診斷試劑原料酶應當具有條件是熱穩(wěn)定性好、pH 穩(wěn)定范圍寬，Km 數值較低。目前，國內對診斷原料用酶研究較少，對新的診斷用原料用酶的酶學性質研究更是相對滯后。所以對國產診斷用原料酶的酶學性質進行研究對正確使用酶法診斷試劑有指導意義。

該研究對麥迪卡公司生產的谷氨酸脫氫酶的酸堿耐受范圍、熱穩(wěn)定性、最適溫度、最適pH 和Km 進行了測定。該種谷氨酸pH 耐受范圍較寬，在pH 為5～10 范圍內保持較好的穩(wěn)定性；熱穩(wěn)定性較好，50 ℃加熱20 min，酶活保留87.5%；酶動力學研究表明該種谷氨酸脫氫酶3個底物的米氏常數分別為：NN4＋是10.4×10-3mol/L；α-酮戊二酸是7.42×10-3mol/L；輔酶I（NADH）是6.65×10-4mol/L。實驗結果表明，麥迪卡公司生產的谷氨酸脫氫酶酶學性質較好，適合臨床診斷試劑盒使用。

[1]羅侃，崔有民.診斷用酶的研究進展[J].西北國防醫(yī)學雜志，2000，21（1）：57－59.

[2]王燕，宋香，楊平平，等.谷氨酸生產菌S9114 中的谷氨酸脫氫酶的研究[J].生物工程學報，2003（19）：725-729.

[3]張克旭，劉永生.天津短桿菌T6－13 谷氨酸脫氫酶的研究[J].微生物學報，1991，31（4）：281－286.

[4]郭紹麗，張連祥，蔡忠，等.谷氨酸脫氫酶液態(tài)試劑盒的制備與臨床應用[J].中國中西醫(yī)結合消化雜志，2000，9（1）：46－47.

[5]郭建，姜國湖，王燕鳴.血清酶法鉀、鈉測定及其評價[J].中華醫(yī)學檢驗雜志，1998（5）：32.

[6]楊艷玲.血氨檢測有助于腦病、肝病的病因診斷[J].中國醫(yī)刊，2006，（3）：19-22.

[7]劉蘭英，劉寶琦，曹亞光，等.谷氨酸脫氫酶（GDH）的性質[J].吉林大學自然科學學報，1993（3）：119-121.