甘油磷酸膽堿的層析純化及其穩(wěn)定性研究

高志榮，趙艷艷，張洪斌，崔云龍，曹明成

(1.合肥工業(yè)大學醫(yī)院;2.合肥工業(yè)大學醫(yī)學工程學院，安徽合肥 230009;3.合肥創(chuàng)新醫(yī)藥技術有限公司，安徽 合肥 230088)

甘油磷酸膽堿(Glycerophosphatidylcholine，GPC，alpha-GPC)是脂磷脂酰膽堿(PC)分子上的兩個脂肪?；耆凰獾舻漠a(chǎn)物。藥物代謝動力學表明:PC被吸收進入血液循環(huán)，分布在各器官，它也是人體內分泌代謝的水溶性小分子物質，能通過血腦屏障，為重要的神經(jīng)傳遞質乙酰膽堿(Acetylcholine)的生物合成前體［1－2］。根據(jù)“膽堿能損傷假說”［3］，老年癡呆癥的發(fā)病機制(記憶力、認知障礙等)與神經(jīng)遞質乙酰膽堿水平降低密切相關，如果提高腦內乙酰膽堿水平，可以顯著改善老年癡呆患者認識功能損傷的癥狀。有專利報道了甘油磷酸膽堿和茴拉西坦同時服用，可以治療阿爾茨海默氏癥［4］。臨床研究表明:GPC治療腦缺血性中風［5］、阿爾茨海默氏癥［6］、多發(fā)性腦梗死型癡呆［7］療效顯著。臨床用于改善中毒性肝損傷等保肝作用［8］;同時，GPC 還具有顯著的防衰老、降血脂、健腦等多種功效，作為保健品及藥物制劑的研究與應用正越來越受到重視。GPC已經(jīng)在意大利、波蘭、韓國、俄羅斯、希臘、智利、巴西等國家上市，可在我國，還處于研發(fā)階段。本試驗，采用三氧化二鋁脫色法［9］和硅膠柱層析法［10］相結合的工藝對甘油磷酸膽堿進行分離純化，并采用高效液相色譜法對其在強光照射、高溫、高濕等條件下的穩(wěn)定性進行研究，從而為其生產(chǎn)、包裝、貯存、制劑研發(fā)等提供科學依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 上海民橋精密科學儀器有限公司SL202N型電子天平;長沙湘儀離心機有限公司TG16－WS臺式高速離心機;江蘇金壇晶玻實驗儀器廠HH－2型恒溫水浴鍋;美國ALLTECH2000蒸發(fā)光散射檢測器，配備單島津液相LC－10ATVP輸液泵，六通閥手動進樣，浙江大學N2000色譜工作站。

1.2 主要試藥 GPC粗品由合肥工業(yè)大學醫(yī)學工程學院實驗室酶法生產(chǎn);GPC對照品從意大利Euticals S.pA公司購買;GPC產(chǎn)品(批號為100301，100302，100303)由本實驗室分離純化制得。無水乙醇、甲醇、二氯甲烷均為天津四友公司生產(chǎn)的分析純試劑，乙腈為天津四友公司生產(chǎn)的色譜純試劑，所用水為超純水機制備的去離子水;三氧化二鋁和硅膠粉均為100～200目，由國藥集團生產(chǎn)。

2 方法與結果

2.1 甘油磷酸膽堿的層析純化

2.1.1 三氧化二鋁和硅膠粉的預處理 三氧化二鋁的預處理:將三氧化二鋁平鋪在容器中，于250℃的烘箱中烘烤4 h待用;硅膠粉的預處理:將硅膠粉平鋪在容器中，于105℃的烘箱中烘烤30 min待用。

2.1.2 三氧化二鋁對甘油磷酸膽堿粗品脫色 選擇甘油磷酸膽堿與三氧化二鋁的質量比為1∶10。在燒杯中稱取實驗室制備的甘油磷酸膽堿約10 g，加入無水乙醇約100 mL，置于50℃的恒溫水浴鍋中保溫，攪拌，使得甘油磷酸膽堿完全溶解后，加入約100 g經(jīng)過預處理的三氧化二鋁，攪拌脫色2 h，離心分離，除去下層三氧化二鋁。將上層溶液蒸發(fā)濃縮除去溶劑，得到塑黃色的甘油磷酸膽堿4.2 g。

2.1.3 硅膠柱層析法進一步純化甘油磷酸膽堿稱取約210 g經(jīng)過預處理的硅膠粉，用甲醇溶脹24 h后，濕法裝柱。將經(jīng)過三氧化二鋁脫色的4.2 g甘油磷酸膽堿產(chǎn)品溶于少量乙醇中，小心的加入層析柱內。緩慢的加入洗脫劑(甲醇∶乙醇∶氯仿=60∶35∶15)進行洗脫，分段收集柱下端流出的洗脫液，檢測，合并含有甘油磷酸膽堿的洗脫液，蒸發(fā)濃縮除去溶劑，得到甘油磷酸膽堿產(chǎn)品。

2.2 甘油磷酸膽堿的含量測定及穩(wěn)定性研究

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取意大利Euticals S.pA公司的GPC對照品適量，用流動相溶解后，轉移至100 mL容量瓶中定容，得到約10 g·L－1的儲備液，冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 色譜條件 浙江大學N2000工作站，色譜柱為 GraceSmart RP C18柱(250 mm ×4.6 mm，5 μm)，流動相為60%乙腈—水溶液，流速為 0.7 mL·min－1，柱溫為(25±1)℃。檢測器為美國Alltech 2000型蒸發(fā)光散射檢測器，漂移管溫度為109℃，載氣為空氣，氣體流速為 3.5 mL·min－1，進樣量為 20 μL。

2.2.3 標準曲線的測定 分別精密吸取GPC對照品儲備液1、2、3、5、10、20 mL，置于 100 mL 容量瓶中，用流動相定容后，搖勻。精密量取20 μL進樣，記錄色譜峰面積。對進樣濃度(mg·L－1)和峰面積分別取對數(shù)，然后以濃度的對數(shù)lnC對甘油磷酸膽堿峰面積的對數(shù)Y進行線性回歸，求得標準曲線方程為:Y=0.538 1lnC －8.722，R2=0.999，線性范圍為100～2 000 mg·L－1。實驗結果見圖1。

通過圖1可以看出，硅膠柱層析后GPC在圖譜上表現(xiàn)為單峰。無論是從外觀上還是從HPLC譜圖上分析，都可以得出結論:通過硅膠柱層析能夠得到GPC純品。

2.2.4 樣品含量測定方法 精密稱取經(jīng)過分離純化的GPC適量，用流動相溶解后，轉移至100 mL容量瓶中定容，得到約10 g·L－1的溶液。精密量取該溶液5 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動相定容至刻度，搖勻。精密量取20 μL進樣，記錄色譜峰面積，并采用外標兩點對數(shù)法計算樣品含量。

2.2.5 回收率試驗 分別精密吸取對照品儲備液3、10 mL，置于100 mL容量瓶中，用流動相定容后，搖勻，作為對照品溶液。精密稱取分離純化的GPC(批號100301)適量，用流動相溶解，分別制成約含GPC 0.4、0.5、0.6 g·L－1的溶液各3 份。精密量取20 μL進樣，記錄色譜峰面積。采用外標兩點對數(shù)法計算含量，并求得回收率。

平均回收率為 99.81%;RSD=0.85%(n=9)。測定結果見表1。

表1 回收率實驗結果(n=9)

2.2.6 精密度試驗 對照品溶液取“2.2.5”項下的對照品溶液。精密稱取分離純化的GPC產(chǎn)品(批號100301)適量，用流動相溶解，制成約含GPC 0.5 g·L－1的溶液。精密量取20 μL進樣，進樣6次，記錄色譜峰面積。采用外標兩點對數(shù)法計算樣品含量，并計算相對標準偏差。結果測得GPC的含量分別為:99.02%、99.67%、100.14%、100.18%、99.28%、99.95%，平均含量為 99.71%，RSD=0.48%(n=6)。

2.2.7 強光照射試驗［11］取分離純化的GPC(批號100301)3份，編號為 100301－1、100301－2、100301－3，分別平鋪在培養(yǎng)皿中，使其厚度≤5 mm，置于澄明度測定儀下(光線強度為4 500 LX)10 d，于第5、10天取樣，與第0天的含量比較，考察其含量變化。平均含量為99.51%;RSD=0.40%(n=9)，結果表明含量無明顯變化，即GPC對光比較穩(wěn)定。試驗結果見表2。

表2 強光照射試驗結果%

2.2.8 高溫試驗 取分離純化的 GPC(批號100301)3份，編號為100301－1、100301－2、100301－3，分別平鋪在培養(yǎng)皿中，使其厚度≤5 mm，在60℃下放置10 d，于第5、10天取樣，與第0天的含量比較，考察其含量變化。計算平均含量為99.65%，RSD 為0.42%(n=9)，結果說明含量無明顯變化，表明GPC原料藥對熱比較穩(wěn)定。試驗結果見表3。

表3 高溫試驗結果

2.2.9 高濕試驗［12］取分離純化的 GPC(批號100301)三份，編號為 100301－1、100301－2、100301－3，分別平鋪在培養(yǎng)皿中，使其厚度≤5 mm，在25℃于相對濕度75%條件下放置10 d，于第5、10天取樣，與第0天的含量比較，考察其含量變化。試驗結果:平均含量為99.30%，RSD為0.47%(n=9)，表明GPC對濕比較穩(wěn)定。試驗結果見表4。

表4 高濕試驗結果

2.2.10 加速試驗 分別取 GPC(批號為100301、100302、100303)各一份，在密閉器皿中于40℃、相對濕度75%的條件下放置6個月，于第1、2、3、6個月月末取樣，與第0個月的含量比較，考察其含量的變化。計算含量平均值為99.61%，RSD為0.57%(n=15)，結果含量無明顯變化，表明 GPC比較穩(wěn)定。試驗結果見表5。

表5 加速試驗結果

2.2.11 長期試驗 分別取 GPC(批號為100301、100302、100303)各一份，在密閉器皿中于25℃，相對濕度60%的條件下放置12個月，于第3、6、9、12個月月末取樣，與第0個月的含量比較，考察其含量的變化。平均含量為99.12%，RSD為0.50%(n=15)，即含量無明顯變化，表明GPC化學性質和物理性質比較穩(wěn)定。試驗結果見表6。

表6 長期試驗結果

2.2.12 重復性試驗 取配制5份濃度為0.5 g·L－1的 GPC 供試品溶液，按“2.2.4”項下色譜條件進行測定，按照上述含量測定方法，測得5份GPC供試品的含量分別為99.83%、100.11%、99.92%、98.57%、99.98%，計算 RSD 為0.63%。結果表明本法測定的重復性良好。

3 討論

試驗結果表明，通過三氧化二鋁脫色法和硅膠柱層析法相結合的工藝對甘油磷酸膽堿進行分離純化，能夠得到含量達99.5%以上的產(chǎn)品。該分離純化工藝簡單，可操作性強，適用于工業(yè)化生產(chǎn)。采用美國Alltech2000型蒸發(fā)光散射檢測器，使用高效液相色譜法研究甘油磷酸膽堿的穩(wěn)定性，根據(jù)檢測結果，GPC色譜峰的理論塔板數(shù)均在3000以上。該方法靈敏、準確、重現(xiàn)性好。通過影響因素試驗、加速試驗和長期試驗考察后，甘油磷酸膽堿的性狀沒有發(fā)生明顯改變，且產(chǎn)品的各項指標均符合中國藥典2010版的規(guī)定，產(chǎn)品的穩(wěn)定性良好。

實事上，甘油磷酸膽堿在意大利LPB公司上市，臨床應用多年，臨床效果顯著。流行病學調查［13］，我國老年癡呆患者約600萬左右，目前尚無特效治療藥物，研發(fā)治療相關疾病新藥是當務之急。根據(jù)國家FDA新藥標準，甘油磷酸膽堿可以做為“只要該活性成分未被批準上市”新藥研究開發(fā)。有關研究表明，新化學實體研發(fā)失敗的原因主要歸結為以下3個方面:安全性、有效性和經(jīng)濟性［14］。本實驗室對以大豆磷脂為原料制備甘油磷酸膽堿進行了深入研究，采用非水相生物催化制備甘油磷酸膽堿［15］，生物催化反應所用試劑毒性小，且有高度專一性，且不改變卵磷脂的天然結構，反應條件溫和，該工藝經(jīng)濟、安全、環(huán)保，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

進一步對甘油磷酸膽堿的鑒別和含量測定方法進行了探索，采用化學鑒別法、薄層色譜鑒別法、HPLC鑒別法和紅外色譜圖鑒別法，能夠簡便、可靠、真實、有效地對甘油磷酸膽堿進行鑒別。所采用的HPLC－ELSD含量檢測法，專屬性強、重現(xiàn)性高，可作為三類新藥GPC的含量標準控制［16］。

綜上所述，本實驗室以大豆磷脂為原料，采用科學、先進的酶法制備和純化GPC的工藝，使產(chǎn)品質量達到申報國家新藥的質量標準。在強光照射、高溫、高濕等條件下的穩(wěn)定性研究結果表明，甘油磷酸膽堿的物理性質和化學性質比較穩(wěn)定，從而為其生產(chǎn)、包裝、貯存、制劑研發(fā)等提供了科學依據(jù)。

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