• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    穩(wěn)定轉(zhuǎn)染ABCG2 shRNA真核沉默載體的人喉癌Hep-2細(xì)胞的建立及其SP檢測

    2014-12-13 06:16:36仇飛飛萬光倫陳召靈呂秋萍
    安徽醫(yī)藥 2014年10期
    關(guān)鍵詞:維拉喉癌干細(xì)胞

    仇飛飛,萬光倫,陳召靈,呂秋萍

    (安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院,安徽合肥 230001)

    喉癌(Laryngeal Carcinoma)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一,它的預(yù)后較差。該病主要發(fā)生在濫用煙酒的成年男性,其特點是鱗狀分化。喉癌通常發(fā)現(xiàn)時患者已經(jīng)是晚期,這導(dǎo)致了喉癌的低治療率和高發(fā)生率[1]。

    越來越多的證據(jù)表明,大量具有異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞有不同的生物學(xué)特性[2]。在這些細(xì)胞中,有一個小族群的細(xì)胞稱為腫瘤干細(xì)胞(CSCs),它導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[3]。腫瘤干細(xì)胞是一類具有永生或無限自我更新能力的細(xì)胞,它們的數(shù)目相對恒定,有強(qiáng)的遷徙、浸潤、轉(zhuǎn)移能力;具有多分化潛能,能分化為不同表型的腫瘤細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞可以通過一系列獨特的細(xì)胞表面標(biāo)記物如CD133、CD24等進(jìn)行分離。在腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞表型(細(xì)胞表面標(biāo)志)未知的情況下,側(cè)群細(xì)胞(side population SP)分選被認(rèn)為從各種組織和細(xì)胞系中分選具有干細(xì)胞潛能的起始細(xì)胞的一種有效的方法[4]。研究認(rèn)為產(chǎn)生SP表型是由于位于細(xì)胞膜上的ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白高表達(dá),SP分離是基于細(xì)胞通過增加ABCG2的表達(dá)來外排Hoechst 33342染料的能力。目前,我們已用喉癌細(xì)胞系Hep-2進(jìn)行了ABCG2的初步探索,ABCG2在SP細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高。因而本實驗利用shRNA特異性沉默ABCG2基因的表達(dá),研究沉默ABCG2后,對Hep-2細(xì)胞的SP細(xì)胞的影響影響,為人喉癌的研究提供有價值的資料。

    1 材料與方法

    1.1 材料 人喉Hep-2細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫;ABCG2 shRNA真核表達(dá)載體購自O(shè)RIGENE,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒為 Invitrogen公司產(chǎn)品,MTT相關(guān)試劑為Sigma公司。嘌呤霉素購自Merck。

    1.2 方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hep-2細(xì)胞用含1%抗生素,10%小牛血清的RPMI-1640的培養(yǎng)基放在37℃ 、5%CO2,條件下培養(yǎng)。

    1.2.2 沉默目的基因的質(zhì)粒載體對Hep-2細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 (1)Hep-2細(xì)胞分為3組,Sh-ABCG2組為轉(zhuǎn)染目的基因質(zhì)粒,Sh-Con為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒,Control為空白對照,接種于六孔板中,37℃ 、5%CO2,條件下培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右。

    (2)轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照lipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。

    (3)嘌呤霉素篩選,2周時觀察細(xì)胞全部死亡的最低嘌呤霉素濃度為最佳篩選濃度,維持使用篩選濃度的一半,熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)正常且表達(dá)較強(qiáng)綠色熒光蛋白時分離陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng),用以檢測ABCG2mRNA和蛋白的表達(dá)。

    1.2.3 RT-PCR 檢測方法 TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA,采用cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照引物設(shè)計原則設(shè)計PCR引物,ABCG2的上、下游引物序列分別為5’-GGGTTCTCTTCTTCCTGACGACC-3’,5’-TGGTTGTGAGATTGACCAACAGACC-3’。擴(kuò)增片段長度399bp,GAPDH上、下游引物序列分別為:5’-TGGCCAAGGTCATCCATGACAACT-3’,5’-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGAGA-3’,擴(kuò)增片段長度100bp。PCR反應(yīng)結(jié)束后于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,凝膠成像系統(tǒng)拍照成像,以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行灰度分析。

    1.2.4 蛋白質(zhì)印記法(Western-blot) 在細(xì)胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法定量蛋白。取40 μg蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE,電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉過夜。洗膜5次,每次5 min。加入稀釋一抗(ABCG2按1∶500稀釋,GAPDH按1∶1 000稀釋),4℃溫育過夜。洗膜5次,每次5 min。加入1∶1 000倍稀釋的二抗,搖床37℃溫育2 h。溫育結(jié)束后,曝光成像。

    1.2.5 SP細(xì)胞的檢測 (1)分選使用的試劑配制:Hoechst33342按1 g·L-1配成原液,維拉帕米按0.5 g·mL-1配成原液,-20℃保存?zhèn)溆?。PI配制成20 mg·L-1的原液,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    (2)各組細(xì)胞SP檢測的步驟:取對數(shù)期生長的各組細(xì)胞,制成濃度為1×109·L-1的單細(xì)胞懸液。檢測時每管加入細(xì)胞懸液 0.8 mL,加入 Hoechst33342至終濃度為5 mg·L-1;各組對照組加入維拉帕米至終濃度為 150 μmol·L-1,孵育30 min后,在加Hoechst33342至終濃度為5 mg·L-1。檢測前20 min加入PI至終濃度為1 mg·L-1。流式細(xì)胞儀上檢測SP比例。

    (3)SP檢測的各組數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)SPSS軟件處理。

    2 結(jié)果

    2.1 熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)ABCG2 shRNA轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞有綠色熒光 熒光顯微鏡下檢測,可以清楚看到熒光表達(dá)如圖1,Sh-ABCG2組轉(zhuǎn)染后的 Hep-2細(xì)胞形態(tài)清楚,在明暗場的對比下,可以看到暗場有綠色熒光,Sh-Con組轉(zhuǎn)染后在暗場綠色熒光,只有Control組在轉(zhuǎn)染后的暗場沒有綠色熒光,表明Sh-ABCG2沉默載體和對照Sh-Con載體已成功轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞中。

    圖1 熒光顯微鏡下觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Hep-2細(xì)胞(×200)

    2.2 嘌呤霉素的篩選濃度 細(xì)胞培養(yǎng)2周時觀察到最佳篩選濃度確定為1.0 mg·L-1,維持濃度為0.5 mg·L-1。

    2.3 ABCG2在mRNA水平的沉默 Hep-2細(xì)胞克隆中的ABCG2 mRNA的表達(dá)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞所提RNA均能擴(kuò)增出GAPDH條帶,如圖2A中1(Sh-Con),2(Sh-ABCG2)所示;Sh-Con組的Hep-2細(xì)胞所提RNA能擴(kuò)增出目的ABCG2基因,如圖2B中1號條帶;Sh-ABCG2組不能擴(kuò)增目的ABCG2基因,如圖2B中的2號條帶;提示ABCG2基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-ABCG2的Hep-2細(xì)胞中mRNA水平得到了沉默。

    圖2 RT-PCR檢測ABCG2的表達(dá)

    2.4 ABCG2在蛋白水平的沉默 Hep-2細(xì)胞克隆中ABCG2蛋白的表達(dá),經(jīng)Western blot檢測,結(jié)果如圖3所示,Sh-ABCG2組所提蛋白中沒有ABCG2蛋白表達(dá),而Sh-Con組和Control組均有ABCG2蛋白表達(dá),Sh-ABCG2組與Sh-Con組和Control組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這表明真核沉默載體已在真核細(xì)胞Hep-2的蛋白水平內(nèi)得到了沉默。

    圖3 Western-blot檢測ABCG2蛋白表達(dá)。

    2.5 SP檢測示Sh-ABCG2組轉(zhuǎn)染后的SP細(xì)胞比例較其他組細(xì)胞明顯降低 轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞在經(jīng)Hoechst33342染色后,以及通過加維拉帕米來抑制SP細(xì)胞外排Hoechst33342染料,得到如下的結(jié)果:Sh-ABCG2組的細(xì)胞在加維拉帕米后SP細(xì)胞比例為(0 ±0.07)%,對照組為(0.3 ±0.10)%,Sh-Con組的細(xì)胞在加維拉帕米后SP細(xì)胞比例為(0.4±0.13)%,對照組為(2.9 ±0.27)%。Control組的細(xì)胞在加維拉帕米后 SP細(xì)胞比例為(0.2±0.08)%,對照組為(3.3 ±0.35)%,Sh-ABCG2 組較Sh-Con組和Control組的SP細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.01)。

    圖4 流式細(xì)胞儀檢測各組SP細(xì)胞

    3 討論

    ABC(三磷酸腺苷結(jié)合盒)轉(zhuǎn)運蛋白,有如ABCB1,P糖蛋白,ABCG2等,他們運輸細(xì)胞中各種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的化合物[5]。ABCG2被稱為半轉(zhuǎn)運蛋白,位于胞漿[6],ABC轉(zhuǎn)運蛋白由全轉(zhuǎn)運子或半轉(zhuǎn)運子組成.全轉(zhuǎn)運子含有12個跨膜區(qū)(Membrane spanning domain.MSD),和2個核苷酸結(jié)合區(qū)(Nucleotide binding domains,NBD),而半轉(zhuǎn)運子只含 6個MSD和1個NBD,這些轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮作用必須條件是組成同型或異性二聚體,目前這種功能二聚體局限于內(nèi)膜[7]。ABCG2能從細(xì)胞轉(zhuǎn)運出一些抗癌劑如伊立替康,SN-38,伊馬替尼,甲氨蝶呤,米托蒽酮[8]。由于同源二聚體發(fā)揮作用,ABCG2的抗性在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時得到穩(wěn)定遺傳。ABCG2在正常組織和腫瘤中都有表達(dá),在機(jī)體內(nèi)可維持干細(xì)胞的穩(wěn)定性和組織細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),保護(hù)細(xì)胞低氧狀態(tài),參與腫瘤干細(xì)胞多抗藥的形成;在腫瘤干細(xì)胞中,ABCG2可以導(dǎo)致干細(xì)胞增殖和自我更新,阻礙干細(xì)胞分化。

    ABCG2在胎盤,血腦屏障,胃腸道、肝,腎、睪丸、哺乳期的乳房中廣泛表達(dá)[9]。ABCG2位于小腸和結(jié)腸的上皮細(xì)胞[10],肝癌細(xì)胞的表面[11]和腎小管腔的表面[12],實驗性抑制ABCG2的活動影響藥物在體內(nèi)的分布[13-14]。在健康志愿者中觀察到ABCG2的表達(dá)沒有性別差異[15]。隨后,免疫組化兩種不同的特異ABCG2抗體BXP-21和BXP-34檢測到ABCG2在小腸和結(jié)腸的上皮,胎盤合胞體滋養(yǎng)層,肝微管膜,乳腺導(dǎo)管和小葉,靜脈和毛細(xì)血管內(nèi)皮高表達(dá),ABCG2在不同的非惡性轉(zhuǎn)移組織(包括小腸,肝臟,腎臟,睪丸,胎盤,血腦屏障)的定位和蛋白表達(dá),揭示了ABCG2的藥物吸收、分布和排泄規(guī)律[16]。Diestra使用單克隆抗體 BXP-21,檢測到ABCG2在所研究的21種腫瘤中的表達(dá),但在消化道(如大腸、食管、胃)、子宮內(nèi)膜和肺相關(guān)的腫瘤以及黑素瘤表達(dá)最強(qiáng)[17]。同時也在急性髓細(xì)胞白血病(AML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)。Shen等在98例LSCC樣本中發(fā)現(xiàn)ABCG2的表達(dá)率為52.0%,而且ABCG2的表達(dá)與其臨床階段,淋巴轉(zhuǎn)移以及總體生存率有重要關(guān)系。ABCG2與her-2的表達(dá)、浸潤性乳腺導(dǎo)管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床階段有關(guān)[18],甚至是乳腺癌惡性進(jìn)展的預(yù)兆及一個獨立預(yù)后因素[19]。在喉癌中,ABCG2也是高表達(dá),本實驗前期已有研究人員發(fā)現(xiàn)ABCG2在Hep-2細(xì)胞中高表達(dá)。Chen等基于RNA干擾方法的研究表明一直ABCG2可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。此外,可以通過fumitremorgin C、化學(xué)抑制劑阻礙ABCG2的功能,也通過長時間抑制細(xì)胞增殖G0/G1間隔[20]。這些數(shù)據(jù)表明,ABCG2可能導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖和自我更新。但是在喉癌Hep-2細(xì)胞中ABCG2的作用還不清楚。

    本實驗前期的研究發(fā)現(xiàn),在喉癌Hep-2細(xì)胞中的SP,NSP以及喉癌Hep-2細(xì)胞中,ABCG2在各組細(xì)胞中的表達(dá) ABCG2在SP細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高,SP與Hep-2及non-SP間CD133的表達(dá)具有顯著性差異(F=21.27,P=0.019)。因此,在喉癌Hep-2細(xì)胞中,ABCG2可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤干細(xì)胞的自我更新。

    本研究用lip2000將ABCG2 shRNA轉(zhuǎn)染到喉癌Hep-2細(xì)胞中,熒光顯微鏡的觀察轉(zhuǎn)染效果,經(jīng)過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株;RT-PCR和Western blot檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株ABCG2的沉默效果;Hep-2細(xì)胞和 Hep-2-shABCG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞經(jīng) Hoechst33342染色,流式細(xì)胞儀檢測SP細(xì)胞比例。綜合檢測結(jié)果,得到如下初步結(jié)論:(1)建立ABCG2 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人喉癌Hep-2細(xì)胞株;(2)ABCG2基因表達(dá)與SP細(xì)胞比例密切相關(guān)。為喉癌和SP細(xì)胞的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。

    [1] 鄭亞玲.喉癌術(shù)后氣道并發(fā)癥的預(yù)見性護(hù)理[J].安徽醫(yī)藥,2012,16(8):1206 -1207.

    [2] JA,EP,SJ.Cancer stem cells:impact,heterogeneity,and uncertainty[J].Cancer Cell,2012,21(3):283 -296.

    [3] H A,F(xiàn) N.Cancer stem cells:a promising concept and therapeutic challenge[J].International Journal of Cancer,2011,129(10):2309.

    [4] Matthew J,Smalley,Robert B,et al.The mammary gland“side population”:A putative stem/progenitor cell marker[J].Journal of Mammary Gland Biology and Neoplasia,2005,10(1):37 -47.

    [5] Natarajan K,Xie Y,Baer MR,et al.Role of breast cancer resistance protein(BCRP/ABCG2)in cancer drug resistance[J].Biochem Pharmacol,2012,83(8):1084 - 1103.

    [6] Schnepf R,Zolk O.Effect of the ATP binding cassette transporter ABCG2 on pharmacokinetics:experimental findings and clinical implications[J].Expert Opin Drug Metab Toxicol,2013,9(3):287-306.

    [7] Michael Dean,Bethesda(MD).The human ATP-binding cassette(ABC)transporter superfamily[J].J Lipid Res,2001,42(7):1007-1017.

    [8] 向陽芳,徐 智.三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G2與多重耐藥及耐藥逆轉(zhuǎn)的研究進(jìn)展[J].中國藥房,2014,25(2):162 -165.

    [9] Blazquez AG,Briz O,Romero MR.Characterization of the role of ABCG2 as a bile acid transporter in liver and placenta[J].Mol Pharmacol,2012,81(2):273 -283.

    [10] Maliepaard M,Scheffer GL,F(xiàn)aneyte IF,et al.Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues[J].Cancer Res,2001,61:3458 -3464.

    [11] Qiang GH,Yu DC,Ding XW,et al.Expression of ABCG2 in human liver cancer cell lines and its related functions[J].Chinese Journal,2012,19:146 -150.

    [12] Fetsch PA,Abati A,Litman T,et al.Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance - associated protein in normal tissues[J].Cancer Lett,2006,235:84 -92.

    [13] Marchetti S,de Vries NA,Buckle T,et al.Effect of the ATPbinding cassette drug transporters ABCB1,ABCG2,and ABCC2 on erlotinib hydrochloride(Tarceva)disposition in vitro and in vivo pharmacokinetic studies employing Bcrp1-/-/Mdr1a/1b-/-(triple-knockout)and wild-type mice[J].Mol Cancer Ther,2008,7:2280 -2287.

    [14] Furman WL,Navid F,Daw NC,et al.Tyrosine kinase inhibitor enhances the bioavailability of oral irinotecan in pediatric patients with refractory solid tumors[J].Clin Oncol,2009,27:4599 -4604.

    [15] 李新星,王 堅.ABCG2和OCT4在膽囊癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].外科理論與實踐,2012,17(1):41 -46.

    [16] Yang Z,Zhu W,Gao S,et al.Breast cancer resistance protein(ABCG2)determines distribution of genistein phase II metabolites:Reevaluation of the roles of ABCG2 in the disposition of genistein[J].Drug Metab Dispos,2012,40(10):1883 -1893.

    [17] Diestra JE,Scheffer GL,CatalàI,et al.Frequent expression of the multi-drug resistance-associated protein BCRP/MXR/ABCP/ABCG2 in human tumors detected by the BXP-21 monoclonal antibody in paraffin-embedded material[J].Pathol,2002,198(2):213-219.

    [18] Xiang L,Su P,Xia S,et al.ABCG2 is associated with HER-2 expression,lymph node metastasis and clinical stage in breast invasive ductal carcinoma[J].Diagnostic Pathology,2011,6(1):90.

    [19] Omran OM.The prognostic value of breast cancer resistance protein(BCRB/ABCG2)expression in breast carcinomas[J].Journal of Environmental Pathology,Toxicology and Oncology,2012,31:367-376.

    [20] Chen Z,Liu F,Ren Q,et al.Suppression of ABCG2 inhibits cancer cell proliferation[J].International Journal of Cancer,2010,126(4):841-851.

    猜你喜歡
    維拉喉癌干細(xì)胞
    干細(xì)胞:“小細(xì)胞”造就“大健康”
    造血干細(xì)胞移植與捐獻(xiàn)
    干細(xì)胞產(chǎn)業(yè)的春天來了?
    缺氧誘導(dǎo)因子-1α在喉癌中的表達(dá)及意義
    喉癌組織中Survivin、MMP—2的表達(dá)、臨床意義及相關(guān)性研究
    干細(xì)胞治療有待規(guī)范
    母與女
    南方周末(2014-09-25)2014-09-25 01:43:01
    ABCG2及其在喉癌中的研究進(jìn)展
    RKDG有限元法求解一維拉格朗日形式的Euler方程
    計算物理(2014年1期)2014-03-11 17:00:14
    磁共振成像在喉癌診斷中的應(yīng)用價值
    亚洲性夜色夜夜综合| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| 中文字幕久久专区| 老鸭窝网址在线观看| 色综合亚洲欧美另类图片| 午夜免费成人在线视频| 国产一区二区三区视频了| 成人性生交大片免费视频hd| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲人成网站在线播放欧美日韩| 一级毛片高清免费大全| 日日夜夜操网爽| 夜夜夜夜夜久久久久| 国产成人福利小说| 精品人妻1区二区| 成人特级黄色片久久久久久久| 99精品在免费线老司机午夜| 色av中文字幕| 一级作爱视频免费观看| 琪琪午夜伦伦电影理论片6080| av国产免费在线观看| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 丁香六月欧美| 亚洲欧美日韩高清专用| 亚洲欧美一区二区三区黑人| 日韩欧美一区二区三区在线观看| 久久久久久九九精品二区国产| 久久精品国产综合久久久| 亚洲国产精品成人综合色| 99国产极品粉嫩在线观看| 中文字幕高清在线视频| 精品午夜福利视频在线观看一区| 高清毛片免费观看视频网站| 欧美性猛交黑人性爽| 午夜免费成人在线视频| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 欧美最新免费一区二区三区 | 精品久久久久久久久久免费视频| 国产精品美女特级片免费视频播放器| 欧美成狂野欧美在线观看| 夜夜爽天天搞| 九色成人免费人妻av| 岛国视频午夜一区免费看| 丰满人妻一区二区三区视频av | 哪里可以看免费的av片| 性欧美人与动物交配| 99精品久久久久人妻精品| 观看美女的网站| 90打野战视频偷拍视频| 国产精品av视频在线免费观看| 亚洲片人在线观看| 亚洲片人在线观看| 国产极品精品免费视频能看的| 国产综合懂色| 又爽又黄无遮挡网站| 老鸭窝网址在线观看| 一个人免费在线观看的高清视频| 国产欧美日韩精品亚洲av| 国产91精品成人一区二区三区| 99国产极品粉嫩在线观看| 久久精品人妻少妇| 国产精品98久久久久久宅男小说| 9191精品国产免费久久| 9191精品国产免费久久| 日本熟妇午夜| 国内精品一区二区在线观看| 91在线观看av| 很黄的视频免费| 午夜福利在线观看吧| 日本 欧美在线| 国产精品 国内视频| 欧美av亚洲av综合av国产av| 怎么达到女性高潮| 国产成人啪精品午夜网站| 久久草成人影院| 在线免费观看不下载黄p国产 | 尤物成人国产欧美一区二区三区| 国产精品久久视频播放| 哪里可以看免费的av片| 色综合亚洲欧美另类图片| 日韩成人在线观看一区二区三区| 亚洲 欧美 日韩 在线 免费| 内射极品少妇av片p| 国产色婷婷99| 久久草成人影院| tocl精华| 亚洲人成电影免费在线| 两人在一起打扑克的视频| 岛国在线免费视频观看| 十八禁网站免费在线| 亚洲av美国av| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 免费大片18禁| 母亲3免费完整高清在线观看| 91久久精品国产一区二区成人 | 国产三级在线视频| 白带黄色成豆腐渣| 免费在线观看影片大全网站| 久久精品91蜜桃| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 色老头精品视频在线观看| 操出白浆在线播放| 天美传媒精品一区二区| 亚洲av电影在线进入| 一个人观看的视频www高清免费观看| 最后的刺客免费高清国语| 丝袜美腿在线中文| 亚洲av电影在线进入| 美女黄网站色视频| 丰满人妻一区二区三区视频av | 精品国产三级普通话版| 他把我摸到了高潮在线观看| 99精品欧美一区二区三区四区| 叶爱在线成人免费视频播放| 午夜福利免费观看在线| 少妇裸体淫交视频免费看高清| 国产精品久久视频播放| 国产伦人伦偷精品视频| 日韩欧美免费精品| 久久久精品欧美日韩精品| 免费看美女性在线毛片视频| 欧美性猛交╳xxx乱大交人| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 亚洲电影在线观看av| 亚洲国产精品合色在线| 亚洲专区国产一区二区| 日韩欧美在线二视频| 国产中年淑女户外野战色| 欧美色视频一区免费| 99在线视频只有这里精品首页| 国产成人影院久久av| 日韩高清综合在线| 女生性感内裤真人,穿戴方法视频| 国产精品三级大全| АⅤ资源中文在线天堂| 午夜a级毛片| 国产一区二区在线观看日韩 | 日本 av在线| 欧美在线黄色| 午夜福利18| 色在线成人网| 日本五十路高清| 人人妻,人人澡人人爽秒播| 久久精品人妻少妇| 欧美最新免费一区二区三区 | 亚洲一区高清亚洲精品| 很黄的视频免费| 99riav亚洲国产免费| 日韩欧美精品免费久久 | 国产精品久久久久久人妻精品电影| 欧美黑人巨大hd| 精品免费久久久久久久清纯| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 欧美在线一区亚洲| 中亚洲国语对白在线视频| 狠狠狠狠99中文字幕| 欧美黑人欧美精品刺激| 丰满的人妻完整版| 国产精品免费一区二区三区在线| 久久久久久久午夜电影| 色播亚洲综合网| 香蕉丝袜av| 精品免费久久久久久久清纯| 九九热线精品视视频播放| 丰满乱子伦码专区| 久久久精品欧美日韩精品| 日本 欧美在线| 国产中年淑女户外野战色| 国产精品一区二区免费欧美| 国产探花在线观看一区二区| 在线播放无遮挡| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| 精品国产亚洲在线| 神马国产精品三级电影在线观看| 五月伊人婷婷丁香| 国产欧美日韩一区二区三| 听说在线观看完整版免费高清| 十八禁网站免费在线| 日韩免费av在线播放| ponron亚洲| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 久久精品夜夜夜夜夜久久蜜豆| 国产精品日韩av在线免费观看| 美女高潮喷水抽搐中文字幕| 久久精品国产清高在天天线| 国产精品av视频在线免费观看| 综合色av麻豆| 岛国在线免费视频观看| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 成人无遮挡网站| 在线观看免费午夜福利视频| 99久久精品国产亚洲精品| 亚洲第一欧美日韩一区二区三区| 久久人妻av系列| 91麻豆av在线| 亚洲精品乱码久久久v下载方式 | 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 国产成+人综合+亚洲专区| 内射极品少妇av片p| 国产乱人伦免费视频| 精品福利观看| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 国产视频一区二区在线看| 久久精品91蜜桃| 亚洲 国产 在线| 国产真实伦视频高清在线观看 | www国产在线视频色| 亚洲成a人片在线一区二区| 久久精品国产99精品国产亚洲性色| 亚洲人成网站在线播| 亚洲一区高清亚洲精品| 18美女黄网站色大片免费观看| 日本a在线网址| tocl精华| 最后的刺客免费高清国语| 九九久久精品国产亚洲av麻豆| 此物有八面人人有两片| 97碰自拍视频| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 听说在线观看完整版免费高清| 女人十人毛片免费观看3o分钟| 日日干狠狠操夜夜爽| 男插女下体视频免费在线播放| 美女高潮的动态| 高清在线国产一区| 成年女人毛片免费观看观看9| 成人无遮挡网站| www.www免费av| 国产美女午夜福利| 天堂影院成人在线观看| 好看av亚洲va欧美ⅴa在| 国产精品野战在线观看| 伊人久久精品亚洲午夜| 久久精品91蜜桃| 久久人人精品亚洲av| 欧美av亚洲av综合av国产av| 亚洲无线在线观看| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 午夜福利成人在线免费观看| 国产激情欧美一区二区| 少妇熟女aⅴ在线视频| 欧美一区二区精品小视频在线| 搡女人真爽免费视频火全软件 | 在线观看66精品国产| 五月伊人婷婷丁香| 综合色av麻豆| 男女视频在线观看网站免费| 床上黄色一级片| 一二三四社区在线视频社区8| 国产高清有码在线观看视频| 国产美女午夜福利| 好男人在线观看高清免费视频| 在线观看免费午夜福利视频| 色av中文字幕| 国产探花在线观看一区二区| 成人国产综合亚洲| 午夜福利高清视频| 最新中文字幕久久久久| 亚洲av电影在线进入| 18禁裸乳无遮挡免费网站照片| 免费搜索国产男女视频| 亚洲欧美日韩高清专用| 欧美另类亚洲清纯唯美| 尤物成人国产欧美一区二区三区| 中文在线观看免费www的网站| 国产亚洲精品综合一区在线观看| 国产精品1区2区在线观看.| 大型黄色视频在线免费观看| avwww免费| 成年女人永久免费观看视频| 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 久9热在线精品视频| 国产日本99.免费观看| 欧美国产日韩亚洲一区| 一级毛片高清免费大全| 精品不卡国产一区二区三区| 免费看a级黄色片| 嫩草影院入口| 熟女人妻精品中文字幕| 最近最新中文字幕大全电影3| 中文字幕精品亚洲无线码一区| 日本黄色片子视频| 欧美最黄视频在线播放免费| 午夜两性在线视频| 日本黄色视频三级网站网址| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 亚洲欧美日韩东京热| 一区二区三区激情视频| 国产蜜桃级精品一区二区三区| 露出奶头的视频| 成人性生交大片免费视频hd| 国产在视频线在精品| 三级男女做爰猛烈吃奶摸视频| 久久亚洲精品不卡| 91久久精品国产一区二区成人 | bbb黄色大片| 国产v大片淫在线免费观看| 国产综合懂色| 久久国产精品影院| 午夜免费观看网址| 亚洲五月天丁香| 亚洲国产中文字幕在线视频| 亚洲欧美精品综合久久99| 两个人看的免费小视频| 黄色日韩在线| 亚洲自拍偷在线| 国产免费av片在线观看野外av| 香蕉丝袜av| 老司机福利观看| 日韩精品中文字幕看吧| 午夜a级毛片| 性色av乱码一区二区三区2| 国产淫片久久久久久久久 | 深爱激情五月婷婷| 男女视频在线观看网站免费| 狂野欧美激情性xxxx| 小蜜桃在线观看免费完整版高清| 亚洲av成人不卡在线观看播放网| 岛国视频午夜一区免费看| 国产91精品成人一区二区三区| 国产三级黄色录像| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 搡老熟女国产l中国老女人| 国产野战对白在线观看| 18禁美女被吸乳视频| 国产成人av教育| 亚洲avbb在线观看| 看黄色毛片网站| 中文字幕av成人在线电影| 亚洲精品美女久久久久99蜜臀| 成人无遮挡网站| 高清在线国产一区| 黄色成人免费大全| 男女做爰动态图高潮gif福利片| 欧美在线一区亚洲| 精品日产1卡2卡| 麻豆一二三区av精品| 一区二区三区高清视频在线| 国产av不卡久久| 高清毛片免费观看视频网站| 三级毛片av免费| 人妻丰满熟妇av一区二区三区| 国产亚洲精品久久久久久毛片| 日韩 欧美 亚洲 中文字幕| 深爱激情五月婷婷| 女警被强在线播放| 免费在线观看日本一区| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 在线观看一区二区三区| 欧美一区二区亚洲| 亚洲欧美激情综合另类| 一区二区三区国产精品乱码| 日韩欧美 国产精品| 亚洲国产欧洲综合997久久,| 真人一进一出gif抽搐免费| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲aⅴ乱码一区二区在线播放| 一本久久中文字幕| e午夜精品久久久久久久| 亚洲一区二区三区不卡视频| 最新中文字幕久久久久| 99riav亚洲国产免费| 精品国内亚洲2022精品成人| 一进一出抽搐gif免费好疼| 免费高清视频大片| 一进一出抽搐动态| 搞女人的毛片| 久久精品国产清高在天天线| 精品一区二区三区视频在线 | 在线观看一区二区三区| 草草在线视频免费看| 亚洲av一区综合| 国内精品久久久久久久电影| 国产亚洲精品一区二区www| 男女下面进入的视频免费午夜| 免费看十八禁软件| 九色国产91popny在线| 欧美日韩精品网址| 日本五十路高清| av视频在线观看入口| 日韩欧美在线二视频| 99视频精品全部免费 在线| 亚洲美女视频黄频| 久久亚洲真实| 天堂网av新在线| 欧美日本亚洲视频在线播放| 欧美zozozo另类| 制服人妻中文乱码| 午夜福利在线观看免费完整高清在 | 欧美不卡视频在线免费观看| 村上凉子中文字幕在线| 夜夜爽天天搞| 日韩大尺度精品在线看网址| 久久久久亚洲av毛片大全| 日本免费a在线| 国产成人av教育| aaaaa片日本免费| 欧美乱码精品一区二区三区| 精华霜和精华液先用哪个| 嫁个100分男人电影在线观看| 激情在线观看视频在线高清| 亚洲熟妇中文字幕五十中出| 国产成人欧美在线观看| 熟女电影av网| 久久久久久国产a免费观看| 欧美丝袜亚洲另类 | 亚洲一区二区三区色噜噜| www.999成人在线观看| 在线看三级毛片| 少妇高潮的动态图| 亚洲精品色激情综合| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | 日韩亚洲欧美综合| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 老熟妇乱子伦视频在线观看| 国产高清激情床上av| 美女cb高潮喷水在线观看| 国产激情欧美一区二区| 亚洲真实伦在线观看| 亚洲av熟女| 久久久久精品国产欧美久久久| 757午夜福利合集在线观看| 少妇人妻一区二区三区视频| 日日干狠狠操夜夜爽| 亚洲人成网站高清观看| 亚洲真实伦在线观看| 两个人视频免费观看高清| 特大巨黑吊av在线直播| 免费无遮挡裸体视频| 国产三级在线视频| 亚洲七黄色美女视频| 一级毛片女人18水好多| 五月伊人婷婷丁香| 国产精品嫩草影院av在线观看 | 亚洲五月婷婷丁香| 国产乱人伦免费视频| 国内少妇人妻偷人精品xxx网站| 综合色av麻豆| 精品午夜福利视频在线观看一区| 免费看光身美女| 国产成人系列免费观看| 搡老妇女老女人老熟妇| 亚洲人成网站在线播| 内射极品少妇av片p| 99久久精品热视频| 久久久久久久精品吃奶| 一本精品99久久精品77| 丰满人妻熟妇乱又伦精品不卡| 久久久久久久久中文| 色综合亚洲欧美另类图片| 在线看三级毛片| 悠悠久久av| 国产精品久久久久久人妻精品电影| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 免费av不卡在线播放| 欧美日韩中文字幕国产精品一区二区三区| 成人无遮挡网站| 天堂影院成人在线观看| 此物有八面人人有两片| 久久天躁狠狠躁夜夜2o2o| 色综合婷婷激情| 国产伦精品一区二区三区视频9 | 怎么达到女性高潮| 国产野战对白在线观看| 欧美色视频一区免费| 一个人看的www免费观看视频| 深夜精品福利| 免费看日本二区| 小说图片视频综合网站| 亚洲av日韩精品久久久久久密| 91麻豆av在线| 色哟哟哟哟哟哟| 精品免费久久久久久久清纯| 国产精品一区二区免费欧美| 欧美日本亚洲视频在线播放| 最近最新免费中文字幕在线| 99久久精品一区二区三区| 在线观看一区二区三区| 成人av在线播放网站| 国产精品一区二区三区四区免费观看 | 搡老熟女国产l中国老女人| 一进一出好大好爽视频| 亚洲欧美激情综合另类| 国产精品亚洲一级av第二区| 极品教师在线免费播放| 国产又黄又爽又无遮挡在线| 国产精品影院久久| 高清毛片免费观看视频网站| 色尼玛亚洲综合影院| 男人舔奶头视频| 国产高清有码在线观看视频| 啦啦啦韩国在线观看视频| 男女下面进入的视频免费午夜| 成人性生交大片免费视频hd| 激情在线观看视频在线高清| 久久久久久国产a免费观看| 国产精品永久免费网站| 亚洲精品在线观看二区| 免费看十八禁软件| 欧美日韩国产亚洲二区| 天堂√8在线中文| 午夜久久久久精精品| 国产精品综合久久久久久久免费| 欧美黑人巨大hd| 又黄又爽又免费观看的视频| or卡值多少钱| 国产97色在线日韩免费| 91久久精品电影网| 成年人黄色毛片网站| 欧美激情久久久久久爽电影| 九九热线精品视视频播放| 一级毛片女人18水好多| 婷婷六月久久综合丁香| 男人和女人高潮做爰伦理| 国产激情欧美一区二区| 午夜a级毛片| 黄色片一级片一级黄色片| 亚洲专区国产一区二区| 日韩欧美免费精品| 免费在线观看日本一区| 亚洲,欧美精品.| 中文在线观看免费www的网站| 国产精品香港三级国产av潘金莲| 一本一本综合久久| 亚洲国产日韩欧美精品在线观看 | bbb黄色大片| 身体一侧抽搐| 亚洲精品久久国产高清桃花| 亚洲欧美日韩东京热| 国产欧美日韩精品亚洲av| 免费在线观看成人毛片| 黄色日韩在线| 长腿黑丝高跟| 亚洲不卡免费看| 亚洲美女黄片视频| 国内精品久久久久久久电影| 99久久久亚洲精品蜜臀av| a在线观看视频网站| h日本视频在线播放| 亚洲狠狠婷婷综合久久图片| 久久久久久久亚洲中文字幕 | 亚洲国产精品999在线| 18禁黄网站禁片午夜丰满| 1000部很黄的大片| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 日韩精品中文字幕看吧| 男女之事视频高清在线观看| 久久人妻av系列| 人人妻人人澡欧美一区二区| 在线看三级毛片| 此物有八面人人有两片| 别揉我奶头~嗯~啊~动态视频| 国产午夜福利久久久久久| 国产精品 国内视频| 在线播放国产精品三级| 日本 av在线| 欧美另类亚洲清纯唯美| 啦啦啦免费观看视频1| av片东京热男人的天堂| 国产高清视频在线播放一区| 久9热在线精品视频| 成人av一区二区三区在线看| 好男人在线观看高清免费视频| 精品一区二区三区视频在线观看免费| 久久久久九九精品影院| 夜夜看夜夜爽夜夜摸| www.www免费av| 99视频精品全部免费 在线| 一区二区三区免费毛片| 两性午夜刺激爽爽歪歪视频在线观看| 天天添夜夜摸| 免费人成在线观看视频色| 国产成人福利小说| 欧美最黄视频在线播放免费| АⅤ资源中文在线天堂| 窝窝影院91人妻| 久久久国产精品麻豆| 丁香六月欧美| 国产精品日韩av在线免费观看| 99久久精品一区二区三区| 国产一区二区激情短视频| 国产精品野战在线观看| 丰满乱子伦码专区| 午夜免费男女啪啪视频观看 | 亚洲av日韩精品久久久久久密| 国产探花在线观看一区二区| 国产一区二区在线av高清观看| 免费一级毛片在线播放高清视频| 欧美一区二区国产精品久久精品| 天堂av国产一区二区熟女人妻| 老汉色av国产亚洲站长工具| 看免费av毛片| 国产一区二区在线av高清观看| 中文字幕高清在线视频| 香蕉丝袜av| 日韩精品中文字幕看吧| 亚洲黑人精品在线| 成人国产综合亚洲| av在线天堂中文字幕| 成人永久免费在线观看视频| 一个人免费在线观看电影| 内射极品少妇av片p| 亚洲av第一区精品v没综合| 成人高潮视频无遮挡免费网站| 最近最新中文字幕大全免费视频| 欧美日韩瑟瑟在线播放| 69av精品久久久久久| 国产精品1区2区在线观看.| 欧美xxxx黑人xx丫x性爽| 九九在线视频观看精品| 久久九九热精品免费| 两个人的视频大全免费| 99在线视频只有这里精品首页| 国产精品综合久久久久久久免费|