仇飛飛,萬光倫,陳召靈,呂秋萍
(安徽醫(yī)科大學(xué)附屬省立醫(yī)院,安徽合肥 230001)
喉癌(Laryngeal Carcinoma)是頭頸部常見的惡性腫瘤之一,它的預(yù)后較差。該病主要發(fā)生在濫用煙酒的成年男性,其特點是鱗狀分化。喉癌通常發(fā)現(xiàn)時患者已經(jīng)是晚期,這導(dǎo)致了喉癌的低治療率和高發(fā)生率[1]。
越來越多的證據(jù)表明,大量具有異質(zhì)性的腫瘤細(xì)胞有不同的生物學(xué)特性[2]。在這些細(xì)胞中,有一個小族群的細(xì)胞稱為腫瘤干細(xì)胞(CSCs),它導(dǎo)致了腫瘤的發(fā)生轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)[3]。腫瘤干細(xì)胞是一類具有永生或無限自我更新能力的細(xì)胞,它們的數(shù)目相對恒定,有強(qiáng)的遷徙、浸潤、轉(zhuǎn)移能力;具有多分化潛能,能分化為不同表型的腫瘤細(xì)胞。腫瘤干細(xì)胞可以通過一系列獨特的細(xì)胞表面標(biāo)記物如CD133、CD24等進(jìn)行分離。在腫瘤干細(xì)胞的細(xì)胞表型(細(xì)胞表面標(biāo)志)未知的情況下,側(cè)群細(xì)胞(side population SP)分選被認(rèn)為從各種組織和細(xì)胞系中分選具有干細(xì)胞潛能的起始細(xì)胞的一種有效的方法[4]。研究認(rèn)為產(chǎn)生SP表型是由于位于細(xì)胞膜上的ABCG2轉(zhuǎn)運蛋白高表達(dá),SP分離是基于細(xì)胞通過增加ABCG2的表達(dá)來外排Hoechst 33342染料的能力。目前,我們已用喉癌細(xì)胞系Hep-2進(jìn)行了ABCG2的初步探索,ABCG2在SP細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高。因而本實驗利用shRNA特異性沉默ABCG2基因的表達(dá),研究沉默ABCG2后,對Hep-2細(xì)胞的SP細(xì)胞的影響影響,為人喉癌的研究提供有價值的資料。
1.1 材料 人喉Hep-2細(xì)胞株購自中科院上海細(xì)胞庫;ABCG2 shRNA真核表達(dá)載體購自O(shè)RIGENE,Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒為 Invitrogen公司產(chǎn)品,MTT相關(guān)試劑為Sigma公司。嘌呤霉素購自Merck。
1.2 方法
1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) Hep-2細(xì)胞用含1%抗生素,10%小牛血清的RPMI-1640的培養(yǎng)基放在37℃ 、5%CO2,條件下培養(yǎng)。
1.2.2 沉默目的基因的質(zhì)粒載體對Hep-2細(xì)胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染 (1)Hep-2細(xì)胞分為3組,Sh-ABCG2組為轉(zhuǎn)染目的基因質(zhì)粒,Sh-Con為轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒,Control為空白對照,接種于六孔板中,37℃ 、5%CO2,條件下培養(yǎng)至細(xì)胞匯合度達(dá)80%左右。
(2)轉(zhuǎn)染嚴(yán)格按照lipofectamineTM2000說明書進(jìn)行。熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染結(jié)果。
(3)嘌呤霉素篩選,2周時觀察細(xì)胞全部死亡的最低嘌呤霉素濃度為最佳篩選濃度,維持使用篩選濃度的一半,熒光顯微鏡下觀察到細(xì)胞形態(tài)正常且表達(dá)較強(qiáng)綠色熒光蛋白時分離陽性克隆并擴(kuò)大培養(yǎng),用以檢測ABCG2mRNA和蛋白的表達(dá)。
1.2.3 RT-PCR 檢測方法 TRIzol法提取各組細(xì)胞總RNA,采用cDNA第一鏈合成試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。按照引物設(shè)計原則設(shè)計PCR引物,ABCG2的上、下游引物序列分別為5’-GGGTTCTCTTCTTCCTGACGACC-3’,5’-TGGTTGTGAGATTGACCAACAGACC-3’。擴(kuò)增片段長度399bp,GAPDH上、下游引物序列分別為:5’-TGGCCAAGGTCATCCATGACAACT-3’,5’-TGTCGCTGTTGAAGTCAGAGGAGA-3’,擴(kuò)增片段長度100bp。PCR反應(yīng)結(jié)束后于1%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳,凝膠成像系統(tǒng)拍照成像,以GAPDH為內(nèi)參進(jìn)行灰度分析。
1.2.4 蛋白質(zhì)印記法(Western-blot) 在細(xì)胞中加入RIPA裂解液提取總蛋白,BCA法定量蛋白。取40 μg蛋白進(jìn)行 SDS-PAGE,電泳結(jié)束后電轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,5%脫脂奶粉封閉過夜。洗膜5次,每次5 min。加入稀釋一抗(ABCG2按1∶500稀釋,GAPDH按1∶1 000稀釋),4℃溫育過夜。洗膜5次,每次5 min。加入1∶1 000倍稀釋的二抗,搖床37℃溫育2 h。溫育結(jié)束后,曝光成像。
1.2.5 SP細(xì)胞的檢測 (1)分選使用的試劑配制:Hoechst33342按1 g·L-1配成原液,維拉帕米按0.5 g·mL-1配成原液,-20℃保存?zhèn)溆?。PI配制成20 mg·L-1的原液,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
(2)各組細(xì)胞SP檢測的步驟:取對數(shù)期生長的各組細(xì)胞,制成濃度為1×109·L-1的單細(xì)胞懸液。檢測時每管加入細(xì)胞懸液 0.8 mL,加入 Hoechst33342至終濃度為5 mg·L-1;各組對照組加入維拉帕米至終濃度為 150 μmol·L-1,孵育30 min后,在加Hoechst33342至終濃度為5 mg·L-1。檢測前20 min加入PI至終濃度為1 mg·L-1。流式細(xì)胞儀上檢測SP比例。
(3)SP檢測的各組數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)SPSS軟件處理。
2.1 熒光顯微鏡發(fā)現(xiàn)ABCG2 shRNA轉(zhuǎn)染的Hep-2細(xì)胞有綠色熒光 熒光顯微鏡下檢測,可以清楚看到熒光表達(dá)如圖1,Sh-ABCG2組轉(zhuǎn)染后的 Hep-2細(xì)胞形態(tài)清楚,在明暗場的對比下,可以看到暗場有綠色熒光,Sh-Con組轉(zhuǎn)染后在暗場綠色熒光,只有Control組在轉(zhuǎn)染后的暗場沒有綠色熒光,表明Sh-ABCG2沉默載體和對照Sh-Con載體已成功轉(zhuǎn)入真核細(xì)胞中。
圖1 熒光顯微鏡下觀察穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后Hep-2細(xì)胞(×200)
2.2 嘌呤霉素的篩選濃度 細(xì)胞培養(yǎng)2周時觀察到最佳篩選濃度確定為1.0 mg·L-1,維持濃度為0.5 mg·L-1。
2.3 ABCG2在mRNA水平的沉默 Hep-2細(xì)胞克隆中的ABCG2 mRNA的表達(dá)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞所提RNA均能擴(kuò)增出GAPDH條帶,如圖2A中1(Sh-Con),2(Sh-ABCG2)所示;Sh-Con組的Hep-2細(xì)胞所提RNA能擴(kuò)增出目的ABCG2基因,如圖2B中1號條帶;Sh-ABCG2組不能擴(kuò)增目的ABCG2基因,如圖2B中的2號條帶;提示ABCG2基因在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh-ABCG2的Hep-2細(xì)胞中mRNA水平得到了沉默。
圖2 RT-PCR檢測ABCG2的表達(dá)
2.4 ABCG2在蛋白水平的沉默 Hep-2細(xì)胞克隆中ABCG2蛋白的表達(dá),經(jīng)Western blot檢測,結(jié)果如圖3所示,Sh-ABCG2組所提蛋白中沒有ABCG2蛋白表達(dá),而Sh-Con組和Control組均有ABCG2蛋白表達(dá),Sh-ABCG2組與Sh-Con組和Control組之間的差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這表明真核沉默載體已在真核細(xì)胞Hep-2的蛋白水平內(nèi)得到了沉默。
圖3 Western-blot檢測ABCG2蛋白表達(dá)。
2.5 SP檢測示Sh-ABCG2組轉(zhuǎn)染后的SP細(xì)胞比例較其他組細(xì)胞明顯降低 轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞在經(jīng)Hoechst33342染色后,以及通過加維拉帕米來抑制SP細(xì)胞外排Hoechst33342染料,得到如下的結(jié)果:Sh-ABCG2組的細(xì)胞在加維拉帕米后SP細(xì)胞比例為(0 ±0.07)%,對照組為(0.3 ±0.10)%,Sh-Con組的細(xì)胞在加維拉帕米后SP細(xì)胞比例為(0.4±0.13)%,對照組為(2.9 ±0.27)%。Control組的細(xì)胞在加維拉帕米后 SP細(xì)胞比例為(0.2±0.08)%,對照組為(3.3 ±0.35)%,Sh-ABCG2 組較Sh-Con組和Control組的SP細(xì)胞比例差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P <0.01)。
圖4 流式細(xì)胞儀檢測各組SP細(xì)胞
ABC(三磷酸腺苷結(jié)合盒)轉(zhuǎn)運蛋白,有如ABCB1,P糖蛋白,ABCG2等,他們運輸細(xì)胞中各種結(jié)構(gòu)不相關(guān)的化合物[5]。ABCG2被稱為半轉(zhuǎn)運蛋白,位于胞漿[6],ABC轉(zhuǎn)運蛋白由全轉(zhuǎn)運子或半轉(zhuǎn)運子組成.全轉(zhuǎn)運子含有12個跨膜區(qū)(Membrane spanning domain.MSD),和2個核苷酸結(jié)合區(qū)(Nucleotide binding domains,NBD),而半轉(zhuǎn)運子只含 6個MSD和1個NBD,這些轉(zhuǎn)運蛋白發(fā)揮作用必須條件是組成同型或異性二聚體,目前這種功能二聚體局限于內(nèi)膜[7]。ABCG2能從細(xì)胞轉(zhuǎn)運出一些抗癌劑如伊立替康,SN-38,伊馬替尼,甲氨蝶呤,米托蒽酮[8]。由于同源二聚體發(fā)揮作用,ABCG2的抗性在轉(zhuǎn)染細(xì)胞時得到穩(wěn)定遺傳。ABCG2在正常組織和腫瘤中都有表達(dá),在機(jī)體內(nèi)可維持干細(xì)胞的穩(wěn)定性和組織細(xì)胞的穩(wěn)態(tài),保護(hù)細(xì)胞低氧狀態(tài),參與腫瘤干細(xì)胞多抗藥的形成;在腫瘤干細(xì)胞中,ABCG2可以導(dǎo)致干細(xì)胞增殖和自我更新,阻礙干細(xì)胞分化。
ABCG2在胎盤,血腦屏障,胃腸道、肝,腎、睪丸、哺乳期的乳房中廣泛表達(dá)[9]。ABCG2位于小腸和結(jié)腸的上皮細(xì)胞[10],肝癌細(xì)胞的表面[11]和腎小管腔的表面[12],實驗性抑制ABCG2的活動影響藥物在體內(nèi)的分布[13-14]。在健康志愿者中觀察到ABCG2的表達(dá)沒有性別差異[15]。隨后,免疫組化兩種不同的特異ABCG2抗體BXP-21和BXP-34檢測到ABCG2在小腸和結(jié)腸的上皮,胎盤合胞體滋養(yǎng)層,肝微管膜,乳腺導(dǎo)管和小葉,靜脈和毛細(xì)血管內(nèi)皮高表達(dá),ABCG2在不同的非惡性轉(zhuǎn)移組織(包括小腸,肝臟,腎臟,睪丸,胎盤,血腦屏障)的定位和蛋白表達(dá),揭示了ABCG2的藥物吸收、分布和排泄規(guī)律[16]。Diestra使用單克隆抗體 BXP-21,檢測到ABCG2在所研究的21種腫瘤中的表達(dá),但在消化道(如大腸、食管、胃)、子宮內(nèi)膜和肺相關(guān)的腫瘤以及黑素瘤表達(dá)最強(qiáng)[17]。同時也在急性髓細(xì)胞白血病(AML)、急性淋巴細(xì)胞白血病(ALL)細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)瘤中高表達(dá)。Shen等在98例LSCC樣本中發(fā)現(xiàn)ABCG2的表達(dá)率為52.0%,而且ABCG2的表達(dá)與其臨床階段,淋巴轉(zhuǎn)移以及總體生存率有重要關(guān)系。ABCG2與her-2的表達(dá)、浸潤性乳腺導(dǎo)管癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床階段有關(guān)[18],甚至是乳腺癌惡性進(jìn)展的預(yù)兆及一個獨立預(yù)后因素[19]。在喉癌中,ABCG2也是高表達(dá),本實驗前期已有研究人員發(fā)現(xiàn)ABCG2在Hep-2細(xì)胞中高表達(dá)。Chen等基于RNA干擾方法的研究表明一直ABCG2可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖。此外,可以通過fumitremorgin C、化學(xué)抑制劑阻礙ABCG2的功能,也通過長時間抑制細(xì)胞增殖G0/G1間隔[20]。這些數(shù)據(jù)表明,ABCG2可能導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖和自我更新。但是在喉癌Hep-2細(xì)胞中ABCG2的作用還不清楚。
本實驗前期的研究發(fā)現(xiàn),在喉癌Hep-2細(xì)胞中的SP,NSP以及喉癌Hep-2細(xì)胞中,ABCG2在各組細(xì)胞中的表達(dá) ABCG2在SP細(xì)胞中的表達(dá)明顯增高,SP與Hep-2及non-SP間CD133的表達(dá)具有顯著性差異(F=21.27,P=0.019)。因此,在喉癌Hep-2細(xì)胞中,ABCG2可能導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞增殖和腫瘤干細(xì)胞的自我更新。
本研究用lip2000將ABCG2 shRNA轉(zhuǎn)染到喉癌Hep-2細(xì)胞中,熒光顯微鏡的觀察轉(zhuǎn)染效果,經(jīng)過嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株;RT-PCR和Western blot檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株ABCG2的沉默效果;Hep-2細(xì)胞和 Hep-2-shABCG2穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞經(jīng) Hoechst33342染色,流式細(xì)胞儀檢測SP細(xì)胞比例。綜合檢測結(jié)果,得到如下初步結(jié)論:(1)建立ABCG2 shRNA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染人喉癌Hep-2細(xì)胞株;(2)ABCG2基因表達(dá)與SP細(xì)胞比例密切相關(guān)。為喉癌和SP細(xì)胞的關(guān)系奠定基礎(chǔ)。
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