HPLC法同時(shí)測定養(yǎng)血安神片中梓醇與毛蕊花糖苷的含量

許 永，趙 成

(1.安徽省六安市中醫(yī)院;2.安徽省六安市食品藥品檢驗(yàn)所，安徽 六安 237000)

養(yǎng)血安神片的主要由地黃、熟地黃、仙鶴草、雞血藤、墨旱蓮、合歡皮、首烏藤等中藥組成，具有滋陰養(yǎng)血，寧心安神的功效。臨床用于治療陰虛血少、頭眩心悸、失眠健忘。其中地黃具有清熱涼血，養(yǎng)陰，生津的作用;熟地黃更有益精補(bǔ)髓、滋陰養(yǎng)血的功效［1］，是方中的君味，主要含有環(huán)稀醚萜苷類如梓醇、毛蕊花糖苷、地黃苷 A，B，C，D、單蜜力特甙、和雙氫梓醇等成分。養(yǎng)血安神片現(xiàn)用質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)仍按1993年衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)中藥成方制劑第八冊進(jìn)行檢驗(yàn)，標(biāo)準(zhǔn)中對可控性強(qiáng)的含量數(shù)據(jù)未作研究，查相關(guān)資料也未有報(bào)道。文中筆者選擇成分中水溶性核苷成分——毛蕊花糖苷以及梓醇作為定量標(biāo)準(zhǔn)［2－3］，通過采用高效液相色譜法來實(shí)現(xiàn)成分含量的測定，以求從多方面控制養(yǎng)血安神片的治療質(zhì)量。

1 儀器與試劑

1.1 儀器 檢測實(shí)驗(yàn)中使用到的儀器為Agilent 1000高效液相色譜儀，其中具體配件包括有在線脫氣機(jī)、四元泵、柱溫箱、VWD紫外檢測器、自動(dòng)進(jìn)樣器以及色譜工作站。梅特勒電子天平XP6U(精密度:0.0001 mg)。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 實(shí)驗(yàn)中用到的試劑主要有乙腈色譜純、自制純化水、甲醇色譜純以及色譜用磷酸等。

1.3 實(shí)驗(yàn)藥品 試驗(yàn)中毛蕊花糖苷對照品購于為中國國家藥品生物制品鑒定所，其批號為110520－201020;梓醇購于為中國國家藥品生物制品鑒定所，其批號為110808－201108。養(yǎng)血安神片為市場隨機(jī)購買(山西亞寶藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司生產(chǎn)，批號:120712、120806、120921)。

2 方法

2.1 測定色譜條件選擇以及系統(tǒng)適應(yīng)性實(shí)驗(yàn) 色譜柱為AgilentSB-AQ，其參數(shù)為(4.6 mm×200 mm，5 μm)，流速控制在 1.0 mL·min－1，檢測波長為210 nm，柱溫保持30℃。流動(dòng)相0.1%磷酸溶液－乙腈:0 ～14.00 min(1%乙腈)，14.01 ～36.00 min(20%乙腈)。理論塔板數(shù)按毛蕊花糖苷峰不低于3 000，而梓醇峰不低于4 000。

2.2 實(shí)驗(yàn)中試液配制

2.2.1 混合對照品溶液制備 精密稱取梓醇對照品5.10 mg以及毛蕊花糖苷對照品 10.20 mg，用(1%乙腈)流動(dòng)相定容至50 mL容量瓶中，均勻混合，得到濃度為 102 mg·L－1以及 204 mg·L－1的對照品混合溶液。

2.2.2 供應(yīng)品溶液制備 取供試品除去包衣，研細(xì)，稱量1.0 g，精密稱定，加入甲醇100 mL，回流90 min，待溶液冷卻后進(jìn)行精密稱重，用甲醇進(jìn)行補(bǔ)重，過濾，取續(xù)濾液10 mL，水浴蒸干。殘?jiān)昧鲃?dòng)相即1%乙腈溶解轉(zhuǎn)移至25ml容量瓶中并定容，即可得到供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液制備依據(jù)藥品所給處方比例稱取除地黃、熟地黃外的其它藥材同樣質(zhì)量，按養(yǎng)血安神片規(guī)定的制作工藝及供應(yīng)品的制備方法來實(shí)現(xiàn)陰性溶液的制備。

2.3 系統(tǒng)試驗(yàn)性試驗(yàn) 分別取出適量混合對照品溶液、供試品溶液以及陰性溶液，用0.45 μm的過濾頭過濾。按照上小節(jié)2.1中所列的色譜條件對三種實(shí)驗(yàn)溶液進(jìn)行進(jìn)樣10 μL，得到圖1，理論塔板數(shù)符合要求。

圖1 HPLC圖

2.4 空白實(shí)驗(yàn) 分別取供應(yīng)品溶液、對照品溶液以及陰性溶液按各10 μL參照上述色譜條件進(jìn)樣實(shí)現(xiàn)毛蕊花糖苷含量的測定，得到的圖譜結(jié)果顯示陰性溶液無干擾(圖1)。

2.5 線性關(guān)系的考察 分別取得2.2.1小節(jié)制備條件下的混合對照品溶液 10、8、6、4、2、1 μL，按照色譜條件來進(jìn)行測定，并記錄每組情況下得到的色譜圖。以進(jìn)樣量(X)對峰面積的積分值(Y)進(jìn)行線性回歸計(jì)算，在處理后得到其回歸方程。梓醇方程表達(dá)為 Y=53 554X －4012，r=0.999 8，線性范圍是0.102 ～ 1.020 μg;毛蕊花糖苷的方程表達(dá)為 Y=2.03 ×106X －1.78 ×104，r=0.999 6，線性范圍是0.204 ～2.04 μg。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 精密稱取同一樣品(批號:120712)共5份，按含量測定項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，按上述色譜條件注入液相色譜儀，計(jì)算梓醇和毛蕊花糖苷的平均含量分別為0.214 mg·g－1(RSD=0.86%);0.478 mg·g－1(RSD=0.95%)。表明本測定法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 精密吸取依法制備的同一供試品溶液，在24 h內(nèi)每隔2 h重復(fù)進(jìn)樣，共12次，每次10 μL，計(jì)算峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)編差分別為RSD=1.15%(n=12)、RSD=1.26%(n=12)。結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 精密度實(shí)驗(yàn) 取適量供試品溶液，進(jìn)行6次重復(fù)進(jìn)樣實(shí)驗(yàn)，最后得出梓醇峰面面積 RSD=0.45%，毛蕊花糖苷峰面面積 RSD=0.56%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明該方法有著良好的實(shí)驗(yàn)精密度。

2.9 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的供試品(批號120806)，平行6份，分別精密加入毛蕊花糖苷以及梓醇對照品適量，按供試品溶液的制備方法處理。測定各含量，結(jié)果見表1和表2?？梢娪么朔y定毛蕊花糖苷和梓醇含量加樣回收率良好，方法準(zhǔn)確、可靠。

表1 梓醇加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)

表2 毛蕊花糖苷加樣回收率實(shí)驗(yàn)(n=6)

2.10 樣品測定 從養(yǎng)血安神片中選取不同的3批次藥品，將適量的藥物粉碎后各取1g，經(jīng)過精密稱定后，依據(jù)2.2.2項(xiàng)下介紹的溶液制備處理方法進(jìn)行溶液配制，同時(shí)將得到的溶液依據(jù)2.1項(xiàng)下的色譜條件的測定，得到的數(shù)據(jù)含量如表3所示。

表3 養(yǎng)血安神片含量測定(n=3)

3 討論

3.1 實(shí)驗(yàn)中測定波長的選擇 查閱有關(guān)資料信息得知毛蕊花糖苷和梓醇吸收波長最為明顯的位置為210 nm以及337 nm處。且梓醇在337 nm波長處沒有明顯的吸收表現(xiàn)，同時(shí)210 nm處的毛蕊花糖苷也幾乎看不出有任何改變。故而在210 nm的波長位置選擇進(jìn)行實(shí)驗(yàn)檢查。

3.2 選擇合適的提取條件［4－6］筆者在進(jìn)行實(shí)驗(yàn)之前曾經(jīng)對甲醇回流最初3 h提取;對飽和正丁醇進(jìn)行3 h回流提取;利用超聲對水飽和正丁醇進(jìn)行40 min處理;在進(jìn)行水溶解后對水飽和正丁醇實(shí)行4次萃取等方法從各方面進(jìn)行了綜合比較，對比結(jié)果顯示用超聲對甲醇進(jìn)行處理最終會(huì)有最高含量的提取，之后又進(jìn)行了不同時(shí)間對甲醇的超聲處理比較，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)在40 min的時(shí)候?qū)θ芤禾崛】梢垣@得最高含量的效果。

3.3 合理選擇色譜方法和梯度條件 試驗(yàn)中參考中國藥典2010年版中對于地黃含量的測定方法，在討論分析之后發(fā)現(xiàn)藥典中毛蕊花糖苷以及梓醇的含量測定中流動(dòng)相成分一致，但比例不同，所以考慮用梯度洗脫，筆者綜合考查了不同流動(dòng)相以及不同梯度條件下混合液的色譜情況，曾選擇0.5%冰醋酸－甲醇(58∶42)、甲醇－乙腈－1%冰醋酸(15∶10∶75)、0.1%并存算－乙腈梯度洗脫用作流動(dòng)相，得到的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)上述配比均不能夠達(dá)到良好的分離效果。最終在參考大量實(shí)驗(yàn)文獻(xiàn)后，經(jīng)過溶液比例調(diào)整，得到1%冰醋酸－乙腈(87∶13)作為流動(dòng)相，此時(shí)就會(huì)實(shí)現(xiàn)溶液良好的分離效果?？梢杂米鲗?shí)驗(yàn)研究檢測。

文中筆者結(jié)合高效液相色譜法實(shí)現(xiàn)了對養(yǎng)血安神片中梓醇與毛蕊花糖苷的同步含量檢測，方法學(xué)檢驗(yàn)證實(shí)有著良好的線性、精密度、重復(fù)性、重現(xiàn)性，并且檢測方法操作簡單方便，能夠?qū)崿F(xiàn)梓醇與毛蕊花糖苷的較好程度分離，因此本法可以選作為養(yǎng)血安神片質(zhì)量控制方法。

［1］ 國家藥典委員會(huì).中國藥典(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:133.

［2］ 張貴財(cái)，朱旭江，杜 興，等.HPLC法測定蘭州肉蓯蓉中毛蕊花糖苷的含量［J］.中國藥事，2010，24(8):802 －803.

［3］ 李才堂，文 萍，郭琦麗.HPLC測定裸花紫珠藥材中毛蕊花糖苷的含量［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18(1):84 －85.

［4］ 霍燕嫻，鄧杏好.HPLC同時(shí)測定壯元益生丸中松果菊苷和毛蕊花糖苷的含量［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2009，3(15):14－15.

［5］ 丁立新，王心合，杜永祥.高效液相色譜法測定桂花中毛蕊花苷的含量［J］.中國當(dāng)代醫(yī)藥，2011，18(21):9 －10.

［6］ 吳 龍.反相高效液相色譜法測定地仲強(qiáng)骨膠囊中毛蕊花糖苷的含量［J］.中南藥學(xué)，2012，10(6):124 －125.