費(fèi)烏瑞它馬鈴薯莖尖分化成苗的培養(yǎng)基篩選與病毒的RT—PCR檢測(cè)

馮光惠+杜虎平+李夏隆+亢福仁

摘要：以分別攜帶3種病毒（PVX、PVY、PLRV）和紡錘塊莖類病毒（PSTVd）的費(fèi)烏瑞它（Favorita）馬鈴薯（Solanum tuberosum）無(wú)菌苗為材料，38 ℃、4 h熱處理4周，剝離帶1個(gè)葉原基的莖尖，接種至不同濃度激素組合的24種MS固體培養(yǎng)基上，24 ℃、16 h培養(yǎng)15 d后統(tǒng)計(jì)莖尖的愈傷組織誘導(dǎo)率和分化成苗率;反轉(zhuǎn)錄PCR（RT-PCR）檢測(cè)莖尖分化再生苗的脫毒率。結(jié)果表明，最適宜費(fèi)烏瑞它馬鈴薯莖尖分化成苗的培養(yǎng)基為MS+0.075 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA +0.10 mg/L GA3，愈傷組織誘導(dǎo)率為75%，分化成苗率為47.5%;再生苗3種病毒PVX、PVY和PLRV的脫毒率分別為65%、90%和100%，紡錘塊莖類病毒PSTVd的脫毒率為10%。

關(guān)鍵詞：費(fèi)烏瑞它馬鈴薯（Solanum tuberosum）;莖尖;分化成苗;培養(yǎng)基;RT-PCR檢測(cè)

中圖分類號(hào)：S532 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? 文章編號(hào)：0439-8114（2014）20-4988-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2014.20.060

Screening the Culture Medium of Favorita Potato Meristem Differentiation

Seedlings and RT-PCR Detection of Virus

FENG Guang-hui， DU Hu-ping， LI Xia-long， KANG Fu-ren

（College of Life Science，Yulin University， Yulin 719000，Shaanxi，China）

Abstract： Aseptic seedlings of Favorita potato carrying three kinds of potato viruses（PVX，PVY，PLRV） and potato spindle tuber viroid （PSTVd） were treated with 38 ℃，4 hours for 4 weeks， stripped with oneleaf primordia of potato meristem，inoculated with 24 kinds of MS solid media of different hormone combinations. The callus induction rate of meristem and differentiation seedling rate after cultured by 24 ℃，16 hours for 15 days were determined statistically. Reverse transcription PCR （RT-PCR） was used to detect the virus-free rate of meristem regeneration. The results showed that the best meristem differentiation medium was MS+0.075 mg/L 6-BA +0.05 mg/L NAA+0.10 mg/L GA3 with the callus inductionrate of 75% and differentiation seedling rate of 47.5%. The rate of detoxification of regenerated plantlets of three potato virus PVX，PVY and PLRV were 65%，90% and 100%. The virus-free rate of potato spindle tuber viroid was 10%.

Key words： Favorita potato; meristem; differentiation seedling; culture medium; RT-PCR detection

脫除馬鈴薯（Solanum tuberosum）病毒和紡錘塊莖類病毒（以下簡(jiǎn)稱類病毒）主要采用莖尖組織培養(yǎng)法，并結(jié)合熱處理[1]、低溫療法[2]和病毒唑法[3]等提高脫毒效果。其中，熱處理結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)法是一種應(yīng)用較廣的馬鈴薯脫毒方法，在葡萄（Vitis vinifera）、草莓（Fragaria×ananassa Duch.）和蘋果（Malus pumila）等植物上也有報(bào)道。但由于不同植物或同一植物不同品種基因型和生理特性的差異，莖尖分化成苗的難易程度也不一樣。以蓋瓊輝等[4]、Iqbal等[5]研究的馬鈴薯莖尖分化成苗培養(yǎng)基作為參考，在同一培養(yǎng)基上對(duì)克新1號(hào)、夏波蒂、費(fèi)烏瑞它、隴薯3號(hào)、布爾班克、青薯9號(hào)、早大白、冀張薯8號(hào)等品種的莖尖培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，這些品種莖尖分化成苗所需的最適培養(yǎng)基不盡相同，其中，費(fèi)烏瑞它品種較難成苗，夏波蒂品種最難成苗。費(fèi)烏瑞它馬鈴薯是榆林地區(qū)近年來(lái)引進(jìn)的優(yōu)良品種之一，該品種具有抗性強(qiáng)、產(chǎn)量高、品質(zhì)優(yōu)的特點(diǎn)。但隨著種植年代的增加，不同病毒或類病毒在塊莖體內(nèi)不斷積累，造成產(chǎn)量和品質(zhì)逐年下降。因此，及時(shí)、有效地控制病毒的傳播是做好脫毒馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的關(guān)鍵。目前，國(guó)內(nèi)關(guān)于費(fèi)烏瑞它馬鈴薯莖尖分化成苗的文獻(xiàn)報(bào)道較少[6-8]。本研究針對(duì)費(fèi)烏瑞它馬鈴薯莖尖分化成苗率較低的原因，以熱處理結(jié)合莖尖剝離脫除病毒和類病毒為目標(biāo)，篩選費(fèi)烏瑞它馬鈴薯莖尖分化成苗最適宜的培養(yǎng)基，并通過RT-PCR方法檢測(cè)再生苗病毒和類病毒的脫毒率，為脫毒苗擴(kuò)繁和種薯繁育奠定基礎(chǔ)。endprint

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?帶毒費(fèi)烏瑞它馬鈴薯無(wú)菌苗 ?采集田間疑似帶毒馬鈴薯植株的塊莖，低溫休眠后，室溫暗處催芽，消毒后接種在MS固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待成苗后擴(kuò)繁，從而建立馬鈴薯無(wú)菌苗體系。用RT-PCR方法檢測(cè)并挑選分別含有3種病毒（PVX、PVY、PLRV）和紡錘塊莖類病毒（PSTVd）的2種材料，由榆林學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 ?藥品和試劑 ?培養(yǎng)基及不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑所含藥品，均購(gòu)自北京康貝斯生物科技有限公司;病毒檢測(cè)的Trizol試劑購(gòu)自invitrogen公司;cDNA合成試劑盒、Taq DNA聚合酶、dNTP、瓊脂糖等購(gòu)自北京全式金生物科技有限公司。

1.1.3 ?引物設(shè)計(jì)及合成 ?根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)上PVX、PVY、PLRV的CP基因序列和PSTVd全基因組序列，利用軟件Primer 5設(shè)計(jì)4對(duì)特異引物，分別是：PVX-F：5′-ACAGGCCACAGGGTCAACTAC-3′，PVX-R：5′-CATCTAGGCTGGCAAAGTCGT-3′;PVY-F：5′-GCCAACTGTGATGAATGGGC-3′，PVY-R：5′-TGTACTGATGCCACCGTCCA-3′;PLRV-F：5′-CGCGCTAACAGAGTTCAGCC-3′，PLRV-R：5′-GCAATGGGGGTCCAACTCAT-3′;PSTVd-F：5′-GATCCCCGGGGAAACCTGGAGC-3′，PSTVd-R：5′-GATCCCTGAAGCGCTCCTCCGAG-3′。

預(yù)期PVX、PVY、PLRV的CP基因序列和PSTVd全基因組序列的擴(kuò)增片段大小分別為620、400、336和251 bp。引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，用滅菌TE（pH 8.0）稀釋至濃度為10 μmol/L。

1.2 ?方法

1.2.1 ?熱處理 ?取生長(zhǎng)至高約1～2 cm的馬鈴薯無(wú)菌苗，在植物培養(yǎng)箱內(nèi)升溫1 ℃/d馴化20 d左右，然后38 ℃光照培養(yǎng)4 h、24 ℃光照培養(yǎng)12 h，光照度3 000 lx，最后20 ℃暗培養(yǎng)8 h，變溫?zé)崽幚?周以鈍化病毒。

1.2.2 ?培養(yǎng)基組成 ?以MS為基本培養(yǎng)基，添加不同質(zhì)量濃度配比的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，其中，細(xì)胞分裂素6-BA的6個(gè)濃度分別為0、0.025、0.050、0.075、0.100、0.150 mg/L，生長(zhǎng)素NAA的4個(gè)濃度分別為0、0.025、0.050、0.075 mg/L，赤霉素GA3的濃度為0.100 mg/L，共組成24種培養(yǎng)基，蔗糖30 g/L，卡拉膠5 g/L，pH 5.8。

1.2.3 ?莖尖剝離與接種 ?剪取熱處理后長(zhǎng)勢(shì)較好的無(wú)菌苗（部分?jǐn)U繁無(wú)菌苗因耐熱差而長(zhǎng)勢(shì)弱或死亡），以注射器針代替解剖針在40倍的體視顯微鏡下進(jìn)行莖尖剝離。因剝離莖尖越大，成活率越高，但脫毒率低，為提高再生苗的脫毒率，試驗(yàn)全部剝離帶1個(gè)葉原基的莖尖，莖尖大小約0.1～0.2 mm，壯苗莖尖稍大，弱細(xì)苗莖尖稍小。培養(yǎng)溫度24 ℃，光照時(shí)間16 h/d，光照度3 000 lx。

為了降低污染率，每個(gè)試管只接種1個(gè)莖尖，每個(gè)處理的培養(yǎng)基接種40個(gè)莖尖。8 d后觀察并記錄莖尖生長(zhǎng)情況，15 d后統(tǒng)計(jì)莖尖的愈傷組織誘導(dǎo)率、分化成苗率。愈傷組織誘導(dǎo)率=形成愈傷組織個(gè)數(shù)/接種莖尖個(gè)數(shù)×100%;分化成苗率=分化成苗個(gè)數(shù)/接種莖尖個(gè)數(shù)×100%。

1.2.4 ?RT-PCR檢測(cè) ?為檢測(cè)馬鈴薯莖尖剝離再生苗病毒和類病毒的脫除情況，隨機(jī)挑選熱處理前攜帶3種病毒（PVX、PVY、PLRV）和類病毒（PSTVd）且莖尖剝離分化后長(zhǎng)勢(shì)良好的再生苗各20株，擴(kuò)繁2代后分別以RT-PCR法進(jìn)行病毒檢測(cè)。Trizol法提取馬鈴薯再生苗葉片總RNA，反轉(zhuǎn)錄（RT）合成cDNA，PCR分別擴(kuò)增不同病毒和類病毒的目的基因片段，1.5%瓊脂糖凝膠電泳PCR產(chǎn)物。PCR反應(yīng)體系為：模板DNA 3 μL，正向（F）引物1 μL，反向（R）引物1 μL，10×PCR Buffer 5 μL，2.5mmol/L dNTPs 4 μL，TaqDNA聚合酶1 μL，加ddH2O至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃變性30 s，PVX、PSTVd 50 ℃（PVY、PLRV 59 ℃）退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個(gè)循環(huán);72 ℃延伸10 min。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?不同激素組合的培養(yǎng)基對(duì)莖尖分化成苗的影響

從表1可以看出，剝離帶1個(gè)葉原基的莖尖接種在不同激素組合的24種培養(yǎng)基中均能形成愈傷組織，F(xiàn)06培養(yǎng)基的愈傷組織誘導(dǎo)率最低，為37.5%;F13和F19培養(yǎng)基愈傷組織誘導(dǎo)率最高，為82.5%，表明費(fèi)烏瑞它馬鈴薯的莖尖分生組織容易發(fā)生脫分化。但是莖尖分化成苗率相對(duì)低且差異較大，F(xiàn)19培養(yǎng)基沒有分化成苗，F(xiàn)16培養(yǎng)基誘導(dǎo)愈傷組織再分化的能力最高，分化成苗率達(dá)47.5%，F(xiàn)17和F23培養(yǎng)基的分化成苗率也比較高，分別為37.5%和32.5%。所以，最適合費(fèi)烏瑞它馬鈴薯的莖尖分化成苗的培養(yǎng)基為MS+0.075 mg/L 6-BA+0.05 mg/L NAA +0.10 mg/L GA3。

2.2 ?費(fèi)烏瑞它馬鈴薯莖尖分化成苗過程分析

觀察莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的生長(zhǎng)情況發(fā)現(xiàn)，除由莖尖剝離技術(shù)引起生長(zhǎng)點(diǎn)破壞或接種速度慢造成莖尖失水而死亡外，8～12 d時(shí)均能形成淺綠色的愈傷組織。15 d 后愈傷組織可分化出幼芽和單條主根（圖1a），30 d后觀察成苗情況發(fā)現(xiàn)，除F19培養(yǎng)基只形成愈傷組織和根系而不能分化成苗外（圖1b），其他23種培養(yǎng)基均能誘導(dǎo)愈傷組織分化成苗。不同培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化再生苗的生長(zhǎng)勢(shì)有所差異，分化成苗率低的培養(yǎng)基，再生苗一般表現(xiàn)出植株莖干矮小纖細(xì)（圖1c）或莖干粗細(xì)不均、葉片稀少（圖1d）等現(xiàn)象;分化成苗率高的培養(yǎng)基，如F16、F17培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的再生苗生長(zhǎng)勢(shì)多數(shù)較好，表現(xiàn)為植株莖桿健壯均勻、葉片大而綠、根系多且發(fā)達(dá)（圖1e、圖1f）。由于通過愈傷組織形成再生苗可能發(fā)生變異，試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)個(gè)別再生苗雖生長(zhǎng)健壯卻失去費(fèi)烏瑞它莖干原有的紫紅色，葉片和莖干均為綠色（圖1g），但擴(kuò)繁后的再生苗又恢復(fù)了莖干的紫紅色，是否發(fā)生變異還需通過逐代繁殖的田間植株表現(xiàn)來(lái)驗(yàn)證或分子遺傳學(xué)分析鑒定。endprint

2.3 ?再生苗病毒和類病毒的RT-PCR檢測(cè)

凝膠成像檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯莖尖剝離脫毒前后RT-PCR電泳條帶差異明顯（圖2），其中，2、4、6、8泳道為脫毒前的檢測(cè)結(jié)果，均擴(kuò)增出不同病毒和類病毒的目的條帶;3、5、7泳道和9泳道沒有擴(kuò)增出目的條帶，表明被檢測(cè)再生苗不含病毒PVX、PVY、PLRV或類病毒PSTVd;部分再生苗的RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)出目的條帶，表明還未脫除相應(yīng)的病毒或類病毒。

檢測(cè)20株再生苗3種病毒PVX、PVY和PLRV后發(fā)現(xiàn)，20株全部不攜帶PLRV，18株不攜帶PVY，13株不攜帶PVX。2株攜帶PVY的再生苗同時(shí)攜帶PVX，表明X病毒較難脫除，Y病毒次之，卷葉病毒最容易脫除，3種病毒PVX、PVY和PLRV的脫毒率分別為65%、90%和100%。由類病毒PSTVd的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20株再生苗中有2株脫除了類病毒，脫毒率為10%，表明熱處理結(jié)合莖尖剝離脫毒法很難脫除PSTVd。

3 ?小結(jié)與討論

3.1 ?莖尖脫毒與分化成苗

熱處理結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)法是國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用的馬鈴薯脫毒技術(shù)，能有效地脫除危害馬鈴薯生長(zhǎng)的常見病毒和類病毒，如PVX、PVY、PLRV、PVS、PVA、PVM和PSTVd等。但是，不同病毒脫除難易差別較大，對(duì)一般馬鈴薯品種而言，通常PVS、PVX較難脫除，PLRV容易脫除，本研究的試驗(yàn)結(jié)果和國(guó)外一些學(xué)者[9-11]研究的結(jié)論是一致的。對(duì)于PVS、PVX等較難脫除的病毒，主要采用的是熱處理、低溫療法和病毒唑法等結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)法。而脫除馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd，目前仍沒有理想的方法，主要以篩選田間抗類病毒植株的塊莖為主。在檢測(cè)無(wú)體細(xì)胞變異的情況下，以二次或多次莖尖剝離法來(lái)提高類病毒的脫毒效果，但必需淘汰可能變異的組培苗，典型費(fèi)烏瑞它馬鈴薯組培苗應(yīng)具有紫紅色莖干和葉片，首先從顏色上去除疑似變異組培苗，完全淘汰變異植株還需通過逐代繁殖的田間植株表現(xiàn)來(lái)驗(yàn)證或分子遺傳學(xué)分析鑒定。莖尖組織培養(yǎng)法實(shí)質(zhì)是剝離莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的分生組織，剝離莖尖大小與脫毒程度有直接關(guān)系，剝離莖尖大，不易脫毒，剝離莖尖小，病毒易脫除但不易成活。本試驗(yàn)為獲得脫毒效果更好的再生苗，以剝離帶1個(gè)葉原基的莖尖為外植體，但同時(shí)降低了莖尖分化成苗率，與國(guó)內(nèi)多數(shù)學(xué)者剝離帶1～2或2～3個(gè)葉原基的試驗(yàn)區(qū)別較大。

不同品種的馬鈴薯由于基因型和生理特性不同，需要不同的培養(yǎng)基環(huán)境。因此，篩選不同濃度激素及合適配比的培養(yǎng)基，對(duì)提高馬鈴薯莖尖分化成苗效果尤為重要。通過對(duì)不同品種莖尖分化成苗的培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，費(fèi)烏瑞它馬鈴薯是較難分化成苗的一個(gè)品種，雖然F16、F17和F23培養(yǎng)基的分化成苗率較高，在此基礎(chǔ)上還可探索更合適的培養(yǎng)基，由于培養(yǎng)環(huán)境、其他類型激素組合的培養(yǎng)基對(duì)莖尖分化成苗的影響也需進(jìn)一步去研究。

3.2 ?病毒檢測(cè)

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)馬鈴薯病毒的方法主要采用DAS-ELISA法和RT-PCR法，而馬鈴薯紡錘塊莖類病毒只含有核酸，沒有外殼蛋白，只能用RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)。在RT-PCR基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展了熒光定量及多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，能更好地提高病毒檢測(cè)效率。DAS-ELISA法簡(jiǎn)單、實(shí)用，但容易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，對(duì)病毒含量低的馬鈴薯檢測(cè)效果差;熒光定量及多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)是比較先進(jìn)的馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)，但對(duì)引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)體系要求較嚴(yán)格，也易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。RT-PCR檢測(cè)技術(shù)是一種快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法，只要在反應(yīng)體系中改變不同病毒或類病毒的特異引物，就能同時(shí)檢測(cè)多種馬鈴薯病毒或類病毒，試驗(yàn)準(zhǔn)確率高，且有效克服了假陰性現(xiàn)象，對(duì)同時(shí)檢測(cè)較多馬鈴薯樣品的病毒或類病毒更經(jīng)濟(jì)實(shí)用、快速準(zhǔn)確。

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2.3 ?再生苗病毒和類病毒的RT-PCR檢測(cè)

凝膠成像檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯莖尖剝離脫毒前后RT-PCR電泳條帶差異明顯（圖2），其中，2、4、6、8泳道為脫毒前的檢測(cè)結(jié)果，均擴(kuò)增出不同病毒和類病毒的目的條帶;3、5、7泳道和9泳道沒有擴(kuò)增出目的條帶，表明被檢測(cè)再生苗不含病毒PVX、PVY、PLRV或類病毒PSTVd;部分再生苗的RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)出目的條帶，表明還未脫除相應(yīng)的病毒或類病毒。

檢測(cè)20株再生苗3種病毒PVX、PVY和PLRV后發(fā)現(xiàn)，20株全部不攜帶PLRV，18株不攜帶PVY，13株不攜帶PVX。2株攜帶PVY的再生苗同時(shí)攜帶PVX，表明X病毒較難脫除，Y病毒次之，卷葉病毒最容易脫除，3種病毒PVX、PVY和PLRV的脫毒率分別為65%、90%和100%。由類病毒PSTVd的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20株再生苗中有2株脫除了類病毒，脫毒率為10%，表明熱處理結(jié)合莖尖剝離脫毒法很難脫除PSTVd。

3 ?小結(jié)與討論

3.1 ?莖尖脫毒與分化成苗

熱處理結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)法是國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用的馬鈴薯脫毒技術(shù)，能有效地脫除危害馬鈴薯生長(zhǎng)的常見病毒和類病毒，如PVX、PVY、PLRV、PVS、PVA、PVM和PSTVd等。但是，不同病毒脫除難易差別較大，對(duì)一般馬鈴薯品種而言，通常PVS、PVX較難脫除，PLRV容易脫除，本研究的試驗(yàn)結(jié)果和國(guó)外一些學(xué)者[9-11]研究的結(jié)論是一致的。對(duì)于PVS、PVX等較難脫除的病毒，主要采用的是熱處理、低溫療法和病毒唑法等結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)法。而脫除馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd，目前仍沒有理想的方法，主要以篩選田間抗類病毒植株的塊莖為主。在檢測(cè)無(wú)體細(xì)胞變異的情況下，以二次或多次莖尖剝離法來(lái)提高類病毒的脫毒效果，但必需淘汰可能變異的組培苗，典型費(fèi)烏瑞它馬鈴薯組培苗應(yīng)具有紫紅色莖干和葉片，首先從顏色上去除疑似變異組培苗，完全淘汰變異植株還需通過逐代繁殖的田間植株表現(xiàn)來(lái)驗(yàn)證或分子遺傳學(xué)分析鑒定。莖尖組織培養(yǎng)法實(shí)質(zhì)是剝離莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的分生組織，剝離莖尖大小與脫毒程度有直接關(guān)系，剝離莖尖大，不易脫毒，剝離莖尖小，病毒易脫除但不易成活。本試驗(yàn)為獲得脫毒效果更好的再生苗，以剝離帶1個(gè)葉原基的莖尖為外植體，但同時(shí)降低了莖尖分化成苗率，與國(guó)內(nèi)多數(shù)學(xué)者剝離帶1～2或2～3個(gè)葉原基的試驗(yàn)區(qū)別較大。

不同品種的馬鈴薯由于基因型和生理特性不同，需要不同的培養(yǎng)基環(huán)境。因此，篩選不同濃度激素及合適配比的培養(yǎng)基，對(duì)提高馬鈴薯莖尖分化成苗效果尤為重要。通過對(duì)不同品種莖尖分化成苗的培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，費(fèi)烏瑞它馬鈴薯是較難分化成苗的一個(gè)品種，雖然F16、F17和F23培養(yǎng)基的分化成苗率較高，在此基礎(chǔ)上還可探索更合適的培養(yǎng)基，由于培養(yǎng)環(huán)境、其他類型激素組合的培養(yǎng)基對(duì)莖尖分化成苗的影響也需進(jìn)一步去研究。

3.2 ?病毒檢測(cè)

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)馬鈴薯病毒的方法主要采用DAS-ELISA法和RT-PCR法，而馬鈴薯紡錘塊莖類病毒只含有核酸，沒有外殼蛋白，只能用RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)。在RT-PCR基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展了熒光定量及多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，能更好地提高病毒檢測(cè)效率。DAS-ELISA法簡(jiǎn)單、實(shí)用，但容易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，對(duì)病毒含量低的馬鈴薯檢測(cè)效果差;熒光定量及多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)是比較先進(jìn)的馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)，但對(duì)引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)體系要求較嚴(yán)格，也易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。RT-PCR檢測(cè)技術(shù)是一種快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法，只要在反應(yīng)體系中改變不同病毒或類病毒的特異引物，就能同時(shí)檢測(cè)多種馬鈴薯病毒或類病毒，試驗(yàn)準(zhǔn)確率高，且有效克服了假陰性現(xiàn)象，對(duì)同時(shí)檢測(cè)較多馬鈴薯樣品的病毒或類病毒更經(jīng)濟(jì)實(shí)用、快速準(zhǔn)確。

參考文獻(xiàn)：

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[2] WANG Q C， LIU Y， XIE Y. Cryotherapy of potato shoot tips for efficient elimination of potato leaf roll virus（PLRV） and potato virus Y（PVY） [J].Potato Research，2006，49：116-129.

[3] DANCI O， ERDEI L， VIDACS L. Influence of ribavirin on potato plants regeneration and virus eradication[J]. Journal of Horticulture， Forestry and Biotechnology，2009，12：421-425.

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[9] BIPASHA C， WANG-PRUSKI G F.Rapid regeneration of stable transformants in cultures of potato by improving factors influenceing agrobacterium-mediated transformation[J].Advances in Bioscience and Biotechnology， 2010，1：409-416.

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[11] MAMIDALA P， SWAMY R， NANNA. Efficient in vitro plant regeneration，flowering and fruiting of drawf Tomato cv.Micro-Msk[J].Plant Omics Journal，2009，2（3）：98-102.endprint

2.3 ?再生苗病毒和類病毒的RT-PCR檢測(cè)

凝膠成像檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯莖尖剝離脫毒前后RT-PCR電泳條帶差異明顯（圖2），其中，2、4、6、8泳道為脫毒前的檢測(cè)結(jié)果，均擴(kuò)增出不同病毒和類病毒的目的條帶;3、5、7泳道和9泳道沒有擴(kuò)增出目的條帶，表明被檢測(cè)再生苗不含病毒PVX、PVY、PLRV或類病毒PSTVd;部分再生苗的RT-PCR產(chǎn)物檢測(cè)出目的條帶，表明還未脫除相應(yīng)的病毒或類病毒。

檢測(cè)20株再生苗3種病毒PVX、PVY和PLRV后發(fā)現(xiàn)，20株全部不攜帶PLRV，18株不攜帶PVY，13株不攜帶PVX。2株攜帶PVY的再生苗同時(shí)攜帶PVX，表明X病毒較難脫除，Y病毒次之，卷葉病毒最容易脫除，3種病毒PVX、PVY和PLRV的脫毒率分別為65%、90%和100%。由類病毒PSTVd的檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20株再生苗中有2株脫除了類病毒，脫毒率為10%，表明熱處理結(jié)合莖尖剝離脫毒法很難脫除PSTVd。

3 ?小結(jié)與討論

3.1 ?莖尖脫毒與分化成苗

熱處理結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)法是國(guó)內(nèi)外普遍應(yīng)用的馬鈴薯脫毒技術(shù)，能有效地脫除危害馬鈴薯生長(zhǎng)的常見病毒和類病毒，如PVX、PVY、PLRV、PVS、PVA、PVM和PSTVd等。但是，不同病毒脫除難易差別較大，對(duì)一般馬鈴薯品種而言，通常PVS、PVX較難脫除，PLRV容易脫除，本研究的試驗(yàn)結(jié)果和國(guó)外一些學(xué)者[9-11]研究的結(jié)論是一致的。對(duì)于PVS、PVX等較難脫除的病毒，主要采用的是熱處理、低溫療法和病毒唑法等結(jié)合莖尖組織培養(yǎng)法。而脫除馬鈴薯紡錘塊莖類病毒PSTVd，目前仍沒有理想的方法，主要以篩選田間抗類病毒植株的塊莖為主。在檢測(cè)無(wú)體細(xì)胞變異的情況下，以二次或多次莖尖剝離法來(lái)提高類病毒的脫毒效果，但必需淘汰可能變異的組培苗，典型費(fèi)烏瑞它馬鈴薯組培苗應(yīng)具有紫紅色莖干和葉片，首先從顏色上去除疑似變異組培苗，完全淘汰變異植株還需通過逐代繁殖的田間植株表現(xiàn)來(lái)驗(yàn)證或分子遺傳學(xué)分析鑒定。莖尖組織培養(yǎng)法實(shí)質(zhì)是剝離莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)的分生組織，剝離莖尖大小與脫毒程度有直接關(guān)系，剝離莖尖大，不易脫毒，剝離莖尖小，病毒易脫除但不易成活。本試驗(yàn)為獲得脫毒效果更好的再生苗，以剝離帶1個(gè)葉原基的莖尖為外植體，但同時(shí)降低了莖尖分化成苗率，與國(guó)內(nèi)多數(shù)學(xué)者剝離帶1～2或2～3個(gè)葉原基的試驗(yàn)區(qū)別較大。

不同品種的馬鈴薯由于基因型和生理特性不同，需要不同的培養(yǎng)基環(huán)境。因此，篩選不同濃度激素及合適配比的培養(yǎng)基，對(duì)提高馬鈴薯莖尖分化成苗效果尤為重要。通過對(duì)不同品種莖尖分化成苗的培養(yǎng)基篩選試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，費(fèi)烏瑞它馬鈴薯是較難分化成苗的一個(gè)品種，雖然F16、F17和F23培養(yǎng)基的分化成苗率較高，在此基礎(chǔ)上還可探索更合適的培養(yǎng)基，由于培養(yǎng)環(huán)境、其他類型激素組合的培養(yǎng)基對(duì)莖尖分化成苗的影響也需進(jìn)一步去研究。

3.2 ?病毒檢測(cè)

目前，國(guó)內(nèi)外檢測(cè)馬鈴薯病毒的方法主要采用DAS-ELISA法和RT-PCR法，而馬鈴薯紡錘塊莖類病毒只含有核酸，沒有外殼蛋白，只能用RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè)。在RT-PCR基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展了熒光定量及多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，能更好地提高病毒檢測(cè)效率。DAS-ELISA法簡(jiǎn)單、實(shí)用，但容易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象，對(duì)病毒含量低的馬鈴薯檢測(cè)效果差;熒光定量及多重RT-PCR檢測(cè)技術(shù)是比較先進(jìn)的馬鈴薯病毒檢測(cè)技術(shù)，但對(duì)引物設(shè)計(jì)及PCR反應(yīng)體系要求較嚴(yán)格，也易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。RT-PCR檢測(cè)技術(shù)是一種快速、準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)方法，只要在反應(yīng)體系中改變不同病毒或類病毒的特異引物，就能同時(shí)檢測(cè)多種馬鈴薯病毒或類病毒，試驗(yàn)準(zhǔn)確率高，且有效克服了假陰性現(xiàn)象，對(duì)同時(shí)檢測(cè)較多馬鈴薯樣品的病毒或類病毒更經(jīng)濟(jì)實(shí)用、快速準(zhǔn)確。

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[6] 王 ?萍，王 ?罡，季 ?靜.鈴薯兩個(gè)基因型不同外植體的組織培養(yǎng)與植株再生[J].中國(guó)馬鈴薯，2006，20（6）：326-328.

[7] 李 ?娟，程智慧，張國(guó)裕.四個(gè)馬鈴薯品種幼莖段再生技術(shù)的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)，2006，34（3）：610-614.

[8] 邱 ?礽，陶 ?剛，朱 ?英，等.馬鈴薯品種莖段愈傷組織誘導(dǎo)和植株再生的研究[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009，37（10）：11-13.

[9] BIPASHA C， WANG-PRUSKI G F.Rapid regeneration of stable transformants in cultures of potato by improving factors influenceing agrobacterium-mediated transformation[J].Advances in Bioscience and Biotechnology， 2010，1：409-416.

[10] HALTERMAN D， CHARKOWSKI A， VERCHOT J. Potato，viruses，and seed certification in the USA to provide healthy propagated tubers[J].Pest Technology，2012， 1：1-14.

[11] MAMIDALA P， SWAMY R， NANNA. Efficient in vitro plant regeneration，flowering and fruiting of drawf Tomato cv.Micro-Msk[J].Plant Omics Journal，2009，2（3）：98-102.endprint