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      白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞移植的療效與白介素6、可溶性白介素6受體水平的關(guān)系

      2014-12-11 03:29:56湯慧娟周妙妮傅麗芳洪為松尉曉冬鄭冬娣許愛娥
      中華皮膚科雜志 2014年2期
      關(guān)鍵詞:組織液黑素細(xì)胞白斑

      湯慧娟 周妙妮 傅麗芳 洪為松 尉曉冬 鄭冬娣 許愛娥

      白癜風(fēng)患者黑素細(xì)胞移植的療效與白介素6、可溶性白介素6受體水平的關(guān)系

      湯慧娟 周妙妮 傅麗芳 洪為松 尉曉冬 鄭冬娣 許愛娥

      目的探討白介素6(IL-6)、可溶性白介素6受體(sIL-6R)與白癜風(fēng)患者自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植療效的關(guān)系。方法對53例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者進行自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植,收集白斑區(qū)與非白斑區(qū)的皰液,移植后6個月觀察療效,用ELISA的方法測定白癜風(fēng)患者皮膚組織液中IL-6及sIL-6R水平,比較移植成功組與失敗組白斑區(qū)及非白斑區(qū)組織液中IL-6及sIL-6R水平。結(jié)果白癜風(fēng)患者白斑區(qū)IL-6(113.22±81.20)ng/L與非白斑區(qū)(84.40±48.78)ng/L,及白斑區(qū)sIL-6R(56.28±24.87)ng/L和非白斑區(qū)(53.96±25.67)ng/L配對比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義。移植失敗組與成功組比較:白斑區(qū)IL-6(153.61±100.26)ng/L的濃度明顯高于移植成功組(88.75±55.75)ng/L(P<0.05);非白斑區(qū)濃度(100.26±55.17)ng/L與(74.78±42.50)ng/L比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義,兩組之間sIL-6R的濃度比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。穩(wěn)定時間<1年的白斑區(qū)IL-6(148.46±88.00)ng/L與非白斑區(qū)(114.82±64.66)ng/L均高于穩(wěn)定時間≥1年的白斑區(qū)(93.54±71.07)ng/L與非白斑區(qū)(67.40±25.23)ng/L(P<0.05),而sIL-6R比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。節(jié)段型白斑區(qū)IL-6(77.33±61.70)ng/L明顯低于非節(jié)段型(131.68±84.54)ng/L(P<0.05),非白斑區(qū)IL-6及sIL-6R的組間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。非節(jié)段型患者的移植成功組非白斑區(qū)IL-6(78.25±40.30)ng/L、白斑區(qū)(96.27±53.390)ng/L與失敗組非白斑區(qū)(107.02±42.48)ng/L、白斑區(qū)(178.90±96.48)ng/L比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,sIL-6R在兩組間比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論IL-6在組織液中的異常表達(dá)對白癜風(fēng)患者皮損區(qū)的微環(huán)境改變有一定的影響,可能與自體黑素細(xì)胞移植療效相關(guān)。

      白癜風(fēng);白細(xì)胞介素6受體;白細(xì)胞介素6;黑素細(xì)胞;移植;治療結(jié)果

      白癜風(fēng)是一種自身免疫性疾病,即由T淋巴細(xì)胞發(fā)揮特異性免疫效應(yīng)所致的黑素細(xì)胞損傷。在治療方面,對療效不佳的穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者,自體黑素細(xì)胞移植是治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)的一種方法。洪為松等[1]用自體培養(yǎng)的黑素細(xì)胞移植共治療了632例患者(最大面積達(dá)640 cm2),有效率為82.28%,痊愈率為52.85%,但仍有部分患者移植效果不佳,我們推測可能與白癜風(fēng)患者皮損區(qū)局部微環(huán)境異常有關(guān)。Wu等[2]在白癜風(fēng)患者周圍皮損CD8+T細(xì)胞和黑素細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液中發(fā)現(xiàn)白介素6(IL-6)升高,我們檢測IL-6及可溶性IL-6受體(sIL-6R)的水平,探討是否與移植療效有關(guān)。

      資料與方法

      一、臨床資料

      53例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者均來自我院皮膚科門診。其中男24例,女29例,年齡14~58歲,平均28歲,病程0.9~25年,平均9年,其中節(jié)段型18例,非節(jié)段型35例,診斷與分型均符合文獻[3],根據(jù)患者全身皮損無擴大或新發(fā)≥6個月為穩(wěn)定期,6月以內(nèi)為進展期,53例患者均為穩(wěn)定期,且病情穩(wěn)定時間均在6個月以上。移植部位位于面頸部26例、軀干部17例、四肢10例,移植6個月后觀察療效。所有患者均無甲狀腺等其他自身免疫性疾病及嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書。

      二、方法

      1.皮膚組織液標(biāo)本采集:白癜風(fēng)患者供皮區(qū)選自臀部,常規(guī)消毒后,再用BFY-II皮膚分離儀(浙江紹興衛(wèi)星機械有限公司)負(fù)壓吸皰,在需移植的受皮區(qū)選一定面積也進行負(fù)壓吸皰,用虹膜剪沿皰壁邊緣剪下皰壁時,在大皰下使用滅菌后的1.5 ml的微量離心管,分別收集供皮區(qū)及受皮區(qū)沿皰壁流下的液體,以半徑5 cm,5 000 r/min離心5min,取上清液,至-80℃保存,移植6個月后檢測。

      2.自體培養(yǎng)的黑素細(xì)胞移植[4]:將虹膜剪剪下的供皮區(qū)正常皮膚置于無菌D-Hanks液中,用0.25%胰蛋白酶及0.02%EDTA先后在37℃消化10 min。在立體顯微鏡下刮下角質(zhì)層下及真皮上的細(xì)胞。用D-Hanks液沖洗后以半徑5 cm,1 000 r/min,離心5 min,收集沉淀細(xì)胞重懸浮于黑素細(xì)胞Hul6選擇性培養(yǎng)基(F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基,含bFGF、CT、IBMX和胎牛血清)中,并將細(xì)胞團吹打成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度5×105/ml接種于培養(yǎng)瓶中,置37℃,5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在第3天加入基因素(100 μg/m1)以去除角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的污染,隔天換液1次。當(dāng)黑素細(xì)胞融合后,用0.05%胰酶-EDTA將黑素細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上消化下來進行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最優(yōu)接種量[1]時,將黑素細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上消化下來,離心收集黑素細(xì)胞懸浮于F12培養(yǎng)基中備用。用CO2激光磨削掉利多卡因局部麻醉后的受皮區(qū),根據(jù)移植白斑區(qū)的面積,按600~1 000個細(xì)胞/mm2[5]收集黑素細(xì)胞,用巴氏吸管將細(xì)胞懸液均勻地接種在移植區(qū)。無菌凡士林紗布覆蓋,外敷含F(xiàn)12培養(yǎng)液濕紗布,包扎固定。囑咐患者平臥休息1 h,7~10 d后去除紗布,6個月后觀察移植效果。

      3.皮膚組織液IL-6、sIL-6R的水平的測定:對移植6個月患者白斑區(qū)及非白斑區(qū)皰液中的IL-6、sIL-6R進行檢測。IL-6、sIL-6R的檢測試劑盒均購于上海西塘生物技術(shù)公司,用雙抗體夾心ABCELISA法,按照試劑盒說明書進行操作,予450 nm處測吸光度A值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程式,計算IL-6、sIL-6R濃度。

      4.療效判斷:痊愈為色素恢復(fù) ≥90%,顯效為色素恢復(fù)50%~89%,好轉(zhuǎn)為色素恢復(fù)10%~49%,<10%為無效,移植成功為痊愈+顯效,移植失敗為好轉(zhuǎn)+無效。

      5.統(tǒng)計分析:SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析,計量資料以±s表示,患者自身對比用配對t檢驗,組間比較用兩獨立樣本t檢驗,P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

      結(jié) 果

      一、白癜風(fēng)患者白斑區(qū)和非白斑區(qū)皮膚組織液中IL-6、sIL-6R的檢測

      53例穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者,白斑區(qū)與非白斑區(qū)皮膚組織液中IL-6和sIL-6R的表達(dá)見表1。

      二、IL-6、sIL-6R檢測與移植療效

      隨訪53例自體黑素細(xì)胞移植后的穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者,6月后移植成功33例,失敗20例。移植失敗組白斑區(qū)皮膚組織液中IL-6的濃度比成功組高(P<0.05),非白斑區(qū)失敗組與成功組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。兩組之間sIL-6R的濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05),見表2。

      三、IL-6、sIL-6R檢測與移植穩(wěn)定時間

      53例自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植的白癜風(fēng)患者穩(wěn)定時間均≥6個月,其中穩(wěn)定時間≥1年34例,穩(wěn)定時間<1年19例。穩(wěn)定時間<1年白斑區(qū)IL-6的濃度較穩(wěn)定時間≥1年的濃度高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),穩(wěn)定時間<1年非白斑區(qū)的IL-6濃度顯著高于穩(wěn)定時間 ≥ 1年的濃度(P<0.05);兩組之間sIL-6R的濃度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05),見表 3。

      四、IL-6、sIL-6R檢測與白癜風(fēng)分型

      35例非節(jié)段型及18例節(jié)段型患者白斑區(qū)IL-6的濃度比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);非白斑區(qū)IL-6的水平 為(72.38±57.67)ng/L、(90.58±43.12)ng/L,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。節(jié)段型及非節(jié)段型白斑區(qū)和非白斑區(qū)組織液中sIL-6R的水平無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05),見表4。

      五、非節(jié)段型白癜風(fēng)患者IL-6、sIL-6R與移植療效的關(guān)系

      35例非節(jié)段型患者,隨訪6個月后,移植成功20例,失敗15例,其中白斑區(qū)組織液IL-6的濃度在失敗組明顯高于移植成功組(P<0.05),非白斑區(qū)的失敗組IL-6的濃度與成功組相比,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05);但移植成功組與失敗組白斑區(qū)及非白斑區(qū)組織液中sIL-6R的水平比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P> 0.05),見表5。

      討 論

      白癜風(fēng)移植手術(shù)主要包括自體表皮片移植、自體混懸移植和自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植,其中自體培養(yǎng)黑素移植以供受皮區(qū)1∶100[6]的比例獲得較多的黑素細(xì)胞,更適合較大面積的白癜風(fēng)治療。雖然經(jīng)過個體化培養(yǎng)基進行自體黑素細(xì)胞培養(yǎng)移植治療白癜風(fēng)有較好的療效[7],但仍有部分患者移植失敗或效果不佳,可能與穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者局部白斑皮膚處于免疫異常狀態(tài)[8]相關(guān)。Kirnbauer等[9]認(rèn)為許多細(xì)胞因子如IL-6能導(dǎo)致黑素細(xì)胞表面的細(xì)胞間黏附分子1(ICAM-1)表達(dá)增加,在白癜風(fēng)的免疫性細(xì)胞毒反應(yīng)中,1CAM-1是中性白細(xì)胞與黑素細(xì)胞黏附的必需因子,細(xì)胞間粘附分子可能抑制黑素細(xì)胞的生長[10],IL-6通過增加效應(yīng)細(xì)胞的遷移及效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞間的黏附,誘導(dǎo)黑素細(xì)胞免疫性的損傷。

      表1 白癜風(fēng)患者白斑區(qū)和非白斑區(qū)IL-6、sIL-6R的檢測(±s) ng/L

      表1 白癜風(fēng)患者白斑區(qū)和非白斑區(qū)IL-6、sIL-6R的檢測(±s) ng/L

      注:P值為白斑區(qū)與非白斑區(qū)比較

      組別 例數(shù) IL-6 sIL-6R白斑區(qū) 53 113.22±81.20 56.28±24.87非白斑區(qū) 53 84.40±48.78 53.96±25.67 t值 3.69 2.113 P值<0.01<0.05

      表2 白癜風(fēng)患者移植成功組和失敗組IL-6、sIL-6R的檢測(±s) ng/L

      表2 白癜風(fēng)患者移植成功組和失敗組IL-6、sIL-6R的檢測(±s) ng/L

      注:P值為失敗組與成功組比較

      組別 例數(shù) IL-6 sIL-6R白斑 非白斑 白斑 非白斑失敗組 20 153.61±100.26 100.26±55.17 63.24±26.03 59.75±23.40成功組 33 88.75±55.75 74.78±42.50 52.06±23.54 50.44±26.68 t值 2.655 1.771 1.61 1.288 P值<0.05 >0.05 >0.05 >0.05

      表3 白癜風(fēng)患者穩(wěn)定時間不同的IL-6、sIL-6R的檢測(±s) ng/L

      表3 白癜風(fēng)患者穩(wěn)定時間不同的IL-6、sIL-6R的檢測(±s) ng/L

      注:P值為<1年與≥1年比較

      組別 例數(shù) IL-6 sIL-6R白斑 非白斑 白斑 非白斑<1年 19 148.46±88.00 114.82±64.66 56.84±16.35 54.83±18.80≥1年 34 93.54±71.07 67.40±25.23 55.96±28.79 53.47±29.07 t值 2.475 3.07 0.123 0.183 P值<0.05<0.01 >0.05 >0.05

      表4 白癜風(fēng)患者節(jié)段型及非節(jié)段型IL-6、sIL-6R的檢測(±s)ng/L

      表4 白癜風(fēng)患者節(jié)段型及非節(jié)段型IL-6、sIL-6R的檢測(±s)ng/L

      注:P值為節(jié)段型與非節(jié)段型比較

      組別 例數(shù) IL-6 sIL-6R白斑 非白斑 白斑 非白斑節(jié)段型 18 77.33±61.70 72.38±57.67 56.66±14.94 52.59±17.11非節(jié)段型 35 131.68±84.54 90.58±43.12 56.09±28.88 54.66±29.32 t值 2.666 1.295 0.078 0.275 P值<0.05 >0.05 >0.05 >0.05

      表5 非節(jié)段型白癜風(fēng)患者失敗組與成功組IL-6、sIL-6R的檢測(±s) ng/L

      表5 非節(jié)段型白癜風(fēng)患者失敗組與成功組IL-6、sIL-6R的檢測(±s) ng/L

      注:P值為失敗組與成功組比較

      組別 例數(shù) IL-6 sIL-6R白斑 非白斑 白斑 非白斑失敗組 15 178.90±96.48 107.02±42.48 63.79±29.96 59.31±26.70成功組 20 96.27±53.39 78.25±40.30 50.31±23.38 51.17±31.36 t值 2.991 2.043 1.384 0.808 P值<0.01<0.05 >0.05 >0.05

      本文53例白癜風(fēng)患者白斑區(qū)與非白斑區(qū)皮膚組織液IL-6與sIL-6R的自身配對比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義,說明患者皮損的產(chǎn)生可能與皮損區(qū)IL-6細(xì)胞因子的升高相關(guān),提示IL-6可能參與白癜風(fēng)的發(fā)病機制。這與之前白癜風(fēng)患者血液[10-11]及皮損中[12]發(fā)現(xiàn)IL-6的升高相一致。Wu等[2]從細(xì)胞因子的水平對白癜風(fēng)患者周圍皮損CD8+T細(xì)胞和黑素細(xì)胞共培養(yǎng)的上清液進行研究,發(fā)現(xiàn)IL-6的水平是單獨黑素細(xì)胞培養(yǎng)的3.02倍,是白癜風(fēng)患者外周血與黑素細(xì)胞共培養(yǎng)的17.32倍。

      本文結(jié)果還顯示,移植失敗者白斑區(qū)組織液中IL-6的濃度顯著高于移植成功的患者,且非節(jié)段型患者非白斑區(qū)IL-6的濃度顯著高于白斑區(qū),提示IL-6的異常高表達(dá)可能引起局部微環(huán)境的改變,破壞黑素細(xì)胞,因此,其整體水平可能與移植療效相關(guān)。處于穩(wěn)定期的白癜風(fēng)患者接受移植治療后,洪為松等[13]認(rèn)為穩(wěn)定時間<1年患者的移植療效不如穩(wěn)定時間≥1年或者≥5年的患者,說明穩(wěn)定時間越長,移植療效越好。我們發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定時間<1年的患者白斑區(qū)及非白斑區(qū)的IL-6明顯高于穩(wěn)定時間≥1年的患者,提示穩(wěn)定時間短,移植療效差,可能與局部的微環(huán)境有關(guān)。

      IL-6是種多效應(yīng)的細(xì)胞因子,IL-6通過增加血管的再生,促進傷口的愈合,手術(shù)愈合過程的12 h內(nèi),IL-6水平一直升高[14],我們在12 h內(nèi)收集皰液離心去上清并凍存于-80℃,所以組織液中IL-6水平的升高也可能是由于促炎癥作用引起的自身反應(yīng)。IL-6R蛋白可以以膜結(jié)合和可溶(slL-6R)的兩種形式存在,在血液或組織液中與sIL-6R結(jié)合形成復(fù)合體進行信號轉(zhuǎn)導(dǎo)發(fā)揮生物學(xué)作用。sIL-6R在移植成功組、失敗組、不同穩(wěn)定時間及不同型別的白斑區(qū)及非白斑區(qū)之間的比較沒有差異,我們推測局部IL-6的升高不是通過與受體結(jié)合起作用,或許是刺激IL-17等其他細(xì)胞因子改變局部免疫環(huán)境,影響白癜風(fēng)患者自體黑素細(xì)胞移植的療效,但需要更多樣本證實。

      我們的研究結(jié)果說明,IL-6的異常表達(dá),可能引起皮損區(qū)微環(huán)境的改變,特別是移植失敗者IL-6的高表達(dá)影響移植療效,或許可以作為術(shù)前篩選移植適應(yīng)證患者的指標(biāo)之一,但需要更多樣本來證實。在臨床上應(yīng)用IL-6的阻斷劑,或許可提高臨床移植的療效,值得進一步研究。

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      2013-05-06)

      (本文編輯:吳曉初)

      Efficacy of autologous cultured melanocyte transplantation for and its relationship with the levels of interleukin-6 and soluble interleukin-6 receptor in suction blister fluid from patients with vitiligo

      Tang Huijuan*,Zhou Miaoni,F(xiàn)u Lifang,Hong Weisong,Wei Xiaodong,Zheng Dongdi,Xu Aie.*Hangzhou Clinical College Affiliated to Anhui Medical University,Hangzhou 310009,China

      Xu Aie,Email:xuaiehz@msn.com

      ObjectiveTo investigate the relationship between the efficacy of autologous cultured melanocyte transplantation for and the levels of interleukin-6(IL-6)and soluble IL-6 receptor(sIL-6R)in suction blister fluid from patients with vitiligo.MethodsFifty-three patients with stable vitiligo were included in this study,and

      autologous cultured melanocyte transplantation.Clinical efficacy was evaluated at six months after the transplantation.Suction blister fluid was collected from vitiliginous and non-vitiliginous skin in these patients before and six months after the transplantation.Enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to measure the levels of IL-6 and sIL-6R in the blister fluid.Statistical analysis was done using pairedttest and two independent samplest-test.ResultsSignificant differences were observed in the blister fluid levels of IL-6((113.22±81.20)vs.(84.40±48.78)ng/L,P<0.01)and sIL-6R((56.28±24.87)vs.(53.96±25.67)ng/L,P<0.05)between vitiliginous and non-vitiliginous skin.The unsuccessfully treated patients showed higher levels of IL-6 in vitiliginous skin((153.61±100.26)vs.(88.75±55.75)ng/L,P<0.05)but similar levels of IL-6 in non-vitiliginous skin((100.26±55.17)vs.(74.78±42.50)ng/L,P>0.05)as well as of sIL-6R in both vitiliginous and non-vitiliginous skin compared with the successfully treated patients.The level of IL-6 in the suction blister fluid from both vitiliginous and non-vitiliginous skin was significantly higher in patients with vitiligo stable for less than one year than in those stable for one or more years((148.46±88.00)vs.(93.54±71.07)ng/L,P<0.05;(114.82±64.66)vs.(67.40±25.23)ng/L,P<0.01),but no significant differences were observed for the level of sIL-6R in vitiliginous or non-vitiliginous skin between the two groups of patients(bothP>0.05).Decreased blister fluid level of IL-6 was observed in vitiliginous skin from patients with segmental vitiligo compared with those with non-segmental vitiligo((77.33±61.70)vs.(131.68±84.54)ng/L,P<0.05),but there was no significant difference in the level of IL-6 in non-vitiliginous skin or the level of sIL-6R in vitiliginous and non-vitiliginous skin between the patients with segmental vitiligo and those with non-segmental vitiligo(allP>0.05).Moreover,significant differences were observed in the level of IL-6 in vitiliginous skin((96.27±53.390)vs.(178.90±96.48)ng/L,P<0.01)and non-vitiliginous skin((78.25±40.30)vs.(107.02±42.48)ng/L,P<0.05),but not in the level of sIL-6R (bothP> 0.05)in vitiliginous or non-vitiliginous skin,between the successfully and unsuccessfully treated patients with non-segmental vitiligo.ConclusionsThe abnormal expression of IL-6 may somewhat affect the microenvironment in vitiliginous lesions of patients,which seems to be associated with the efficacy of autologous cultured melanocyte transplantation.

      Vitiligo;Interleukin-6 receptors;Interleukin-6;Melanocytes;Transplantation;Treatment outcome

      10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.02.008

      國家自然科學(xué)基金(81071294、81271758);浙江省自然科學(xué)基金重點項目(Z2100973);省部共建計劃項目(WKJ2012-2-036);杭州市重大科技創(chuàng)新項目(20122513A02)

      310009杭州,安徽醫(yī)科大學(xué)附屬杭州臨床學(xué)院(湯慧娟);杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科(周妙妮、傅麗芳、洪為松、尉曉東、鄭冬娣、許愛娥)

      許愛娥,Email:xuaiehz@msn.com

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