C型凝集素受體樹突細(xì)胞特異性捕獲細(xì)胞間黏附分子3非整合素細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建及功能研究

張宇 姚煦 顧漢艷 王寶璽 劉軍

C型凝集素受體樹突細(xì)胞特異性捕獲細(xì)胞間黏附分子3非整合素細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建及功能研究

張宇 姚煦 顧漢艷 王寶璽 劉軍

目的構(gòu)建C型凝集素受體樹突細(xì)胞特異性捕獲細(xì)胞間黏附分子3非整合素(DC-SIGN)細(xì)胞表達(dá)模型,為后續(xù)進(jìn)行DC-SIGN蛋白受體功能研究提供基礎(chǔ)。方法PCR擴(kuò)增獲得DC-SIGN分子的cDNA,克隆入真核表達(dá)載體p巨細(xì)胞病毒啟動子-綠色熒光蛋白重組質(zhì)粒(PCMV-EGFP),EGFP位于DCSIGN N末端,轉(zhuǎn)染人胚腎細(xì)胞癌HEK 293T細(xì)胞后,流式細(xì)胞儀檢測DC-SIGN重組分子的表達(dá),激光共聚焦顯微鏡檢測DC-SIGN-EGFP融合蛋白的細(xì)胞定位情況,并進(jìn)一步檢測轉(zhuǎn)染表達(dá)的DC-SIGN受體對過敏原抗原的識別和內(nèi)吞過程。結(jié)果構(gòu)建的熒光融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)PCR及Western印跡證明DC-SIGN表達(dá)成功;經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染DC-SIGN融合質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞的DC-SIGN受體表達(dá)量增多(約50%)。重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后,激光共聚焦顯微鏡檢測顯示,綠色熒光標(biāo)記的DC-SIGN位于細(xì)胞膜上,可結(jié)合紅色熒光素標(biāo)記的過敏原抗原Derp2,并可將Derp2內(nèi)吞入細(xì)胞內(nèi)。 結(jié)論 構(gòu)建的DC-SIGN-EGFP融合蛋白在293T細(xì)胞內(nèi)表達(dá)后具有細(xì)胞表面受體分子的特征性分布,可被DC-SIGN特異性抗體識別并具有攝取過敏原功能,是研究DC-SIGN分子功能的理想細(xì)胞模型。

受體,有絲分裂原;重組融合蛋白質(zhì)類;抗原,塵螨屬;細(xì)胞系,腫瘤

樹突細(xì)胞(DC)特異性捕獲細(xì)胞間黏附分子3非整合素(dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin,DC-SIGN)是新近發(fā)現(xiàn)的限制性表達(dá)于DC和某些組織巨噬細(xì)胞上的凝集素樣受體[1],由于胞外區(qū)糖識別域(CRD)可以特異性識別抗原的糖基結(jié)構(gòu),故其自然配體非常廣泛[2]。作為致病原受體,它可以與人類免疫缺陷病毒(HIV)、巨細(xì)胞病毒(CMV)、結(jié)核分枝桿菌和血吸蟲等靶向結(jié)合,且大多數(shù)致病原與該受體靶向結(jié)合后的事件均與病情進(jìn)展密切相關(guān)[1,3-4]。鑒于DCSIGN的DC限制性表達(dá)的特性和作為抗原受體的功能特點(diǎn),推測DC-SIGN同樣是富含多糖的過敏原抗原的靶受體。為了解DC-SIGN對過敏原抗原結(jié)合能力及內(nèi)吞和提呈功能,我們構(gòu)建DC-SIGN熒光融合蛋白真核表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染工程細(xì)胞系人胚腎細(xì)胞癌HEK293T細(xì)胞獲得瞬時(shí)表達(dá),并以激光共聚焦顯微鏡和流式細(xì)胞儀等技術(shù)鑒定熒光融合蛋白的表達(dá)和功能。

材料與方法

一、材料

大腸桿菌DH5α(日本TaKaRa公司),DC-SIGN+pMD18-T質(zhì)粒(北京義翹神州技術(shù)有限公司),p巨細(xì)胞病毒啟動子-綠色熒光蛋白重組質(zhì)粒(PCMVEGFP,上海吉瑪技術(shù)有限公司),HEK 293T細(xì)胞株(美國模式菌種收集中心ATCC),Ex Taq酶、Pyrobest DNA Polymerase、T4 DNA 連接酶、HindⅢ和 BamHⅠ內(nèi)切酶、質(zhì)粒抽提試劑盒和DNA回收試劑盒(日本TaKaRa公司),BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)公司),轉(zhuǎn)染試劑陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine2000(美國Invitrogen公司),小鼠抗人DC-SIGN(美國Abcam公司),Alexa Fluor-647熒光染料(美國Invitrogen公司)。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

二、方法

1.PCR方法得到DC-SIGN序列片段:PCR反應(yīng)體系參照日本TaKaRa公司Ex Taq酶說明書,設(shè)50 μl體系。 DC-SIGN:上游引物:5'-GATATAAGCT TGCCACCATGAGTGACTCCAAGGAACCAAGACTG CA-3',下游引物:5'-GTATCGGATCCCTACGCAGG AGGGGGGTTTGGGGTG-3'。PCR反應(yīng)條件:95℃變性3 min,94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)完成后,利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳并切膠回收DC-SIGN基因片段。

2.重組DC-SIGN分子的克隆及鑒定:按照TaKaRa公司T4 DNA連接酶的說明,將PCMVEGFP質(zhì)粒和DC-SIGN基因片段用HindⅢ和BamHⅠ酶切,10 g/L瓊脂糖凝膠電泳后回收DC-SIGN基因片段和載體PCMV-EGFP。用T4 DNA連接酶連接雙酶切得到的DC-SIGN基因片段和線性化的載體,22℃連接2 h。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)菌,分別以卡那霉素篩選,挑取單克隆抗性菌落擴(kuò)增,小量抽提質(zhì)粒并做酶切鑒定在1 215 bp對應(yīng)區(qū)域有條帶為陽性克隆,質(zhì)粒送上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測序。構(gòu)建成功的質(zhì)粒圖譜見圖1。

3.真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞:按照陽離子脂質(zhì)體Lipofectamine說明書將構(gòu)建的兩個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞,以PCMV空載體為對照。用DMEM培養(yǎng)基(含10%胎牛血清,不含青、鏈霉素)將HEK293T細(xì)胞形成單細(xì)胞懸液,按照每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板,37℃5%CO2培養(yǎng)24 h細(xì)胞貼壁并達(dá)80%～90%融合時(shí),用3 ml D-Hanks液洗滌細(xì)胞2次,加入1 ml DMEM培養(yǎng)基。用不完全DMEM培養(yǎng)基配轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine及重組質(zhì)粒,每孔加入 2 μl Lipofectamine 于 50 μl DMEM,0.89 μg質(zhì)粒 DNA 于50 μl DMEM,質(zhì)粒與脂質(zhì)體終濃度比為 1 μg ∶2.25 μl。將兩試劑室溫混合20 min,將轉(zhuǎn)染混合物逐滴加入已鋪好細(xì)胞的12孔板中混勻后,5%CO237℃培養(yǎng)過夜,轉(zhuǎn)染48 h觀察結(jié)果。

4.激光共聚焦顯微鏡檢測重組DC-SIGNEGFP融合蛋白的表達(dá):將轉(zhuǎn)染48 h的HEK293T細(xì)胞收集,PBS洗1次,按DC-SIGN磁珠分選(德國Miltenyi Biotic公司)說明書步驟,分離表達(dá)CD209受體的HEK293T細(xì)胞,將其繼續(xù)培養(yǎng)12 h。4%多聚甲醛固定30 min;4',6-二瞇基-2-苯基吲哚(DAPI)避光染色10 min后激光共聚焦顯微鏡檢測熒光融合蛋白的表達(dá)。

圖1 重組PCMV-EGFP-DC-SIGN質(zhì)粒圖譜 PCMV-EGFP:p巨細(xì)胞病毒啟動子-綠色熒光蛋白質(zhì)粒;DC-SIGN:樹突細(xì)胞特異性捕獲細(xì)胞間黏附分子3非整合素

5.PCR和Western印跡檢測DC-SIGN基因及蛋白的表達(dá):HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染48 h后,收集細(xì)胞,用TRIzol試劑提取總mRNA,反轉(zhuǎn)為cDNA后,用小片段DC-SIGN產(chǎn)物驗(yàn)證DC-SIGN表達(dá)。小片段DC-SIGN:上游引物5'-AAGTAACCGCTTCACCT GGATGG-3',下游引物5'-GGCAAGATTACATTTGT CGTCGTT-3';內(nèi)參甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH):上游引物5'-AGAAGGCTGGGGCTCAT TTG-3',下游引物5'-AGGGGCCATCCACAGTCTT C-3'。 PCR反應(yīng)條件:95℃變性3 min;94℃30 s,55℃30 s,72℃30 s,30個(gè)循環(huán);最后72℃延伸5 min。PCR反應(yīng)完成后,利用10 g/L瓊脂糖凝膠電泳觀察擴(kuò)增條帶。另一部分細(xì)胞用PBS洗滌2次,用RIPA裂解液以及蛋白酶抑制劑和1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF,美國Sigma公司)抽提總蛋白,按BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒確定樣品蛋白濃度。將蛋白依次上樣后,轉(zhuǎn)移PVDF膜,膜在2%BSA溶液中室溫孵育1 h以封閉非特異性結(jié)合,應(yīng)用終濃度為1.5 mg/L小鼠抗人DC-SIGN一抗孵育1.5 h,TBST緩沖液洗滌后加入過氧化物酶標(biāo)記的羊抗鼠IgG(1∶500)與一抗結(jié)合,室溫孵育1 h,增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法(ECL)試劑作用后ChemiDocXRS系統(tǒng)顯影拍照。分析DCSIGN蛋白表達(dá)情況。

6.激光共聚焦顯微鏡檢測融合蛋白對戶塵螨過敏原的攝取:收獲轉(zhuǎn)染后48 h的HEK293T細(xì)胞。根據(jù)說明書步驟用新型熒光染料Alexa Fluor-647(Molecular Probes)標(biāo)記nDer p 2天然純化過敏原(美國Indoor Biotechnologies公司),標(biāo)記后蛋白終濃度為0.6 g/L。加入20 mg/L Alexa Fluor-647標(biāo)記的nDer p 2過敏原在37℃分別孵育15 min和45 min;用4%多聚甲醛固定25 min,PBS洗3次,加入DAPI核染色劑避光孵育10 min,用激光共聚焦顯微鏡檢測熒光融合蛋白的表達(dá)。

結(jié) 果

一、EGFP-DC-SIGN融合基因表達(dá)載體的構(gòu)建

PCR方法得到帶有HindⅢ和BamHⅠ酶切位點(diǎn)的1 215 bp的DC-SIGN全長編碼框,酶切后連接入PCMV-EGFP真核表達(dá)載體,構(gòu)建出熒光蛋白位于DC-SIGN蛋白N末端的融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒PCMV-EGFP-DC-SIGN。將構(gòu)建的重組質(zhì)粒PCMVEGFP-DC-SIGN用HindⅢ和BamHⅠ酶切,電泳后得到2條片段,位置與理論值一致(1條為1 200 bp,1條為線性載體片段4 700 bp),說明克隆成功。將質(zhì)粒送life公司測序,測序結(jié)果與DC-SIGN序列一致。

二、DC-SIGN熒光融合蛋白的表達(dá)

在HEK-293T細(xì)胞表達(dá)Lipofectamine2000陽離子脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒48 h后,激光掃描共聚焦顯微鏡檢測到有綠色熒光表達(dá),提示EGFP-DCSIGN融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)(圖2)。小片段DC-SIGN擴(kuò)增產(chǎn)物證實(shí)了DC-SIGN的表達(dá)(圖3)。PCR反應(yīng)完成后,瓊脂糖凝膠電泳觀察到280 bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶。十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析顯示,在相對分子質(zhì)量44 000處有條帶,證明DC-SIGN有表達(dá)。流式細(xì)胞儀檢測顯示,轉(zhuǎn)染EGFP-DC-SIGN融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒后,HEK293T細(xì)胞DC-SIGN表達(dá)率為78.89%,較未轉(zhuǎn)染細(xì)胞(29.00%)上升近50%,表達(dá)(熒光)強(qiáng)度上升54.6%(1 063比483)。

三、DC-SIGN融合蛋白對戶塵螨過敏原的攝取能力

見圖4。在過敏原加入HEK293T細(xì)胞后15 min,有熒光素標(biāo)記的過敏原結(jié)合于膜表面的DC-SIGNEGFP融合蛋白上。培養(yǎng)時(shí)間增至45 min時(shí),熒光素標(biāo)記的過敏原逐漸分布至細(xì)胞內(nèi)部。當(dāng)細(xì)胞預(yù)先用封閉性抗體DC-SIGN孵育30 min后,在45 min內(nèi)未見過敏原結(jié)合及內(nèi)吞。

圖2 激光掃描共聚焦顯微鏡檢測HEK293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染PCMV-EGFP-DC-SIGN重組質(zhì)粒 2a:48 h后,細(xì)胞膜上綠色熒光(×400);2b:DAPI染色細(xì)胞核呈藍(lán)色(×200);2c,2d:HEK293T細(xì)胞膜上有綠色熒光蛋白表達(dá)(×200) PCMV-EGFP:p巨細(xì)胞病毒啟動子-綠色熒光蛋白質(zhì)粒;DC-SIGN:樹突細(xì)胞特異性捕獲細(xì)胞間黏附分子3非整合素

討 論

DC是專職性抗原提呈細(xì)胞,是機(jī)體免疫應(yīng)答的始動者,其表面表達(dá)的多種模式識別受體備受關(guān)注。其中,特異性識別富含糖基結(jié)構(gòu)抗原的C型凝集素受體是DC表面的一大類重要的模式識別受體[5]。研究發(fā)現(xiàn),DC-SIGN在介導(dǎo)病原微生物致病和腫瘤免疫逃逸等方面發(fā)揮作用[5-6]。DC-SIGN屬Ⅱ型跨膜蛋白,其C末端位于胞外區(qū),而N末端位于胞內(nèi)區(qū),胞外區(qū)CRD蛋白表面的兩個(gè)環(huán)形突起形成2個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn):一個(gè)在CRD構(gòu)型及協(xié)調(diào)其結(jié)合糖類配體中發(fā)揮重要作用;另一個(gè)在糖類配體結(jié)構(gòu)的空間定位上起關(guān)鍵作用。CRD可識別結(jié)合含甘露糖以及含巖藻糖成分病原體或過敏原。胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域主要包括一些內(nèi)化基序[7]。體外結(jié)合試驗(yàn)顯示,DC-SIGN受體可與多種富含多糖結(jié)構(gòu)的過敏原抗原特異性結(jié)合。但是體外結(jié)合試驗(yàn)不能代表活體細(xì)胞真實(shí)情況,本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行DC-SIGN細(xì)胞表達(dá)模型的構(gòu)建,旨在為后續(xù)進(jìn)行功能研究提供細(xì)胞模型。

圖3 PCR檢測轉(zhuǎn)染后HEK293T細(xì)胞中樹突細(xì)胞特異性捕獲細(xì)胞間黏附分子3非整合素(DC-SIGN)的表達(dá) M:標(biāo)準(zhǔn)參照物;1:DC-SIGN小片段驗(yàn)證產(chǎn)物,約280 bp;2:甘油醛-3-磷酸脫氫酶內(nèi)參照

圖4 樹突細(xì)胞特異性捕獲細(xì)胞間黏附分子3非整合素(DCSIGN)受體對Alexa Fluor-647標(biāo)記的nDer p 2過敏原的結(jié)合和內(nèi)吞(×800) 4a:4b～4d的重疊圖;4e:4f～4h的重疊圖。藍(lán)色熒光為4',6-二瞇基-2-苯基吲哚染色標(biāo)記定位細(xì)胞核,綠色熒光代表DCSIGN受體表達(dá)于細(xì)胞膜表面,紅色熒光代表Der p 2過敏原

構(gòu)建熒光融合表達(dá)蛋白是進(jìn)行分子細(xì)胞內(nèi)示蹤的常見方法,但必須使重組質(zhì)粒獲得表達(dá)后仍然具有天然分子分布特征和生物學(xué)功能。文獻(xiàn)報(bào)道[8],將熒光蛋白EGFP置于DC-SIGN的C末端可能會影響DC-SIGN對配體的識別,故我們將EGFP置于DC-SIGN的N末端構(gòu)建熒光融合蛋白重組表達(dá)質(zhì)粒,經(jīng)PCR及Western印跡檢測證明DC-SIGN表達(dá)成功;經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測DC-SIGN受體表達(dá)增高。HEK293T細(xì)胞系是常見的工程細(xì)胞,微弱或不表達(dá)Toll樣受體,少量表達(dá)C型凝集素受體,故我們選擇HEK293T細(xì)胞系為轉(zhuǎn)染細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn),DC-SIGN的表達(dá)水平增加50%,可用來作為DCSIGN細(xì)胞模型來進(jìn)行后續(xù)功能研究。

本研究證實(shí),融合蛋白表達(dá)后綠色熒光主要位于細(xì)胞膜上,流式細(xì)胞儀檢測轉(zhuǎn)染DC-SIGN融合質(zhì)粒的HEK293T細(xì)胞DC-SIGN受體表達(dá)量增多,表達(dá)融合DC-SIGN蛋白在15 min時(shí)可結(jié)合紅色熒光標(biāo)記的Derp2抗原,后者與融合蛋白的綠色熒光有較好的共聚現(xiàn)象,45 min觀察時(shí)紅色熒光已經(jīng)內(nèi)吞進(jìn)入胞內(nèi),紅色熒光與核染色的藍(lán)色熒光出現(xiàn)共聚現(xiàn)象。

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2013-09-02)

(本文編輯:尚淑賢)

A cellular model for the expression of the C-type lectin dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin:construction and functional analysis

Zhang Yu*,Yao Xu,Gu Hanyan,Wang Baoxi,Liu Jun.*Institute of Dermatology,Chinese Academy of Medical Sciences and Peking Union Medical College,Nanjing 210042,China

s:Yao Xu,Email:dryao_xu@126.com;Liu Jun,Email:drliu_jun@126.com

ObjectiveTo establish a cellular model for the expression of the C-type lectin dendritic cellspecific intercellular adhesion molecule-3-grabbing non-integrin (DC-SIGN),and to provide a basis for the functional analysis of DC-SIGN.MethodsThe cDNA of DC-SIGN was obtained via PCR,and cloned into the eukaryotic expression vector porcine cytomegalovirus-enhanced green fluorescent protein(PCMV-EGFP)with EGFP at the N terminal of DC-SIGN.Then,the recombinant PCMV-EGFP-DC-SIGN plasmid was transfected into HEK293T cells followed by the detection of DC-SIGN expression using PCR,Western blot and flow cytometry.Confocal microscopy was performed to localize the expression of DC-SIGN-EGFP and visualize the recognization and internalization of the Derp2 allergen by DC-SIGN.ResultsThe recombinant fluorescent fusion protein-expressing plasmid was successfully constructed.Both PCR and Western blot confirmed the expression of DC-SIGN.Flow cytometry showed that the expression of DC-SIGN was increased by approximately 50%in HEK293T cells transfected with the recombinant expression plasmid compared with those untransfected.As confocal microscopy showed,the green fluorescence-labelled DC-SIGN was located on the cell membrane,which could bind to the red fluorescence-labelled antigen Derp2 and internalize it into the cells.ConclusionsThe recombinant DC-SIGNEGFP fusion protein is characteristically located on the surface of 293T cells,which can be recognized by the DCSIGN-specific antibody and is capable of internalizing the allergen Derp2,and may serve as an ideal cell model for further studies on molecular function of DC-SIGN.

Receptors,mitogen;Recombinant fusion proteins;Antigens,dermatophagoides;Cell line,tumor

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.07.002

國家自然科學(xué)基金(81171501);江蘇省自然科學(xué)基金(BK2011127)

210042南京,中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院皮膚病研究所(張宇、姚煦、顧漢艷、王寶璽);南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院皮膚科(劉軍)

姚煦,Email:dryao_xu@126.com;劉軍,Email:drliu_jun@126.com