編碼桔小實(shí)蠅抗阿維菌素的GABA 受體基因5'端序列片段克隆與分析

章玉蘋，陸永躍，梁廣文，曾 玲

(1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)研究室，廣州 510642;2.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，廣東省植物保護(hù)新技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州 510640)

桔小實(shí)蠅Bactrocera dorsalis (Hendel)是世界許多國家和地區(qū)的重要危險(xiǎn)性害蟲，也是我國熱帶亞熱帶地區(qū)重要經(jīng)濟(jì)害蟲之一，對(duì)水果等作物造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。該蟲原發(fā)于我國臺(tái)灣和日本琉球群島一帶，后傳到20 多個(gè)國家和地區(qū)，現(xiàn)已在我國許多地區(qū)發(fā)生(曾玲等，2006;梁廣勤等，2002;劉玉章等，1981)。自2003年以來我國桔小實(shí)蠅田間種群的抗藥性問題已突顯出來，2004年臺(tái)灣報(bào)道了桔小實(shí)蠅種群對(duì)十種農(nóng)藥(二溴磷 Naled、敵百蟲 Trichlorfon、殺螟硫 磷Fenitrothion、倍硫磷 Fenthion、滅蚜硫Formothion、馬拉硫 Malathion、滅多威Methomyl、氟氯氰菊酯 Cyfluthrin、氯氰菊酯Cypermethrin、氰戊菊酯Fenvalerate)抗性發(fā)展規(guī)律，發(fā)現(xiàn)桔小實(shí)蠅種群對(duì)二溴磷的抗性上升最慢，對(duì)馬拉硫磷的抗性上升最迅速(潘志萍等，2005;Hsu et al.，2000;章玉蘋等，2008)。我國大陸華南地區(qū)桔小實(shí)蠅發(fā)生為害猖獗，2004年已發(fā)現(xiàn)部分地區(qū)的桔小實(shí)蠅種群已對(duì)阿維菌素產(chǎn)生了低水平的抗性，2005年低水平抗性或敏感的田間種群抗性均上升，大部分達(dá)到了中抗水平，甚至接近高抗水平(曾玲等，2006;林進(jìn)添等，2004;章玉蘋等，2008)。

阿維菌素(Avermectin)是一種大環(huán)內(nèi)酯抗生素類殺蟲殺螨劑，它主要是通過干擾蟲體內(nèi)的γ-氨基丁酸(GABA)系統(tǒng)，使蟲體處于麻痹狀態(tài)而死亡，具有廣譜高效、低毒、低殘留、安全性高等特點(diǎn)(Lasota and Dybas，1991)。害蟲對(duì)阿維菌素的抗性問題仍不容忽視。目前已發(fā)現(xiàn)家蠅Musca domestica L.、馬鈴薯甲蟲Leptinotarsa decemlineata Say、二斑葉螨Tetranychus urticae Koch、德國蜚蠊Blattela germanica Linnaeus、小菜蛾 Plutella xylostella Linnaeus、三葉斑潛蠅 Liriomyza trifoli Burgess 等對(duì)阿維菌素產(chǎn)生了一定的抗性(梁廣勤等，2002;潘志萍等，2005;章玉蘋等，2008;Kaku and Matsumura，1994;Thompson et al.，1993)。其神經(jīng)不敏感性抗性機(jī)制的分子機(jī)理主要有兩方面:GABA 受體數(shù)目的變化和受體的質(zhì)變。作為殺蟲劑重要的靶標(biāo)之一，GABA 受體的研究已成為殺蟲劑毒理機(jī)制研究的熱點(diǎn)之一。到目前為止，雖然關(guān)于阿維菌素對(duì)許多昆蟲作用機(jī)制的研究較多，分子水平研究越來越迅速發(fā)展，但在桔小實(shí)蠅體內(nèi)的作用機(jī)制的研究仍主要集中于生理生化水平。關(guān)于桔小實(shí)蠅GABA 受體基因克隆和序列分析國內(nèi)外均未見報(bào)道。本文在前人對(duì)其它昆蟲GABA受體研究的基礎(chǔ)上，對(duì)編碼桔小實(shí)蠅的GABA 受體基因進(jìn)行研究，主要是通過克隆室內(nèi)選育的對(duì)阿維菌素有高水平抗性的抗性品系及敏感品系中編碼GABA 受體基因序列片段進(jìn)行比對(duì)，初步從基因水平上探索桔小實(shí)蠅對(duì)阿維菌素產(chǎn)生抗性的分子機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx

1.1.1 飼養(yǎng)方法

敏感品系(Susceptilble strain，簡(jiǎn)稱SS):華南農(nóng)業(yè)大學(xué)昆蟲生態(tài)研究室提供。

抗性品系(Avermectin-selected strain of LC90，簡(jiǎn)稱AvR90):以2003年3月采自廣州市郊的野外桔小實(shí)蠅種群作為抗性品系篩選的原始材料，將采集的桔小實(shí)蠅在養(yǎng)蟲室飼養(yǎng)1-2 代穩(wěn)定后，幼蟲采用微量點(diǎn)滴法處理，將藥液點(diǎn)滴于幼蟲胸部背面，處理后的幼蟲放入濕潤(rùn)的沙中，待其化蛹、羽化正常的成蟲繼續(xù)飼養(yǎng)。成蟲采用藥膜法，測(cè)定親代(F0)成蟲對(duì)阿維菌素的毒力后，在此基礎(chǔ)上采用LC90濃度進(jìn)行群體篩選，每隔三代進(jìn)行一次毒力測(cè)定，并分別用所測(cè)定的LC90濃度藥劑處理后三代蟲，使其種群形成不同抗藥性品系，經(jīng)過多代汰選培育形成。

1.1.2 毒力測(cè)定與計(jì)算方法

采用藥膜法。將試藥劑用丙酮配制成母液，稀釋成5-6 個(gè)濃度。將5 mL 藥液倒入250 mL 三角瓶中，搖動(dòng)，當(dāng)瓶壁上形成均勻藥膜后，將藥液倒掉。待丙酮完全揮發(fā)后，引入桔小實(shí)蠅成蟲，放入沾有5%蜜糖水棉球后用紗布封住瓶口并用橡皮圈扎緊，倒立放置于室溫25-28℃下，設(shè)丙酮為對(duì)照。每處理3 次重復(fù)，每重復(fù)10 頭，72 h 后檢查死亡率。以將其翻身后30 s 內(nèi)不能翻轉(zhuǎn)為死亡。對(duì)照組死亡率在10%以下為有效試驗(yàn)。

1.1.3 毒力計(jì)算方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)均用Excel 軟件處理，計(jì)算出各藥劑的毒力回歸方程、致死中濃度(LC50)及其95%置信度、相關(guān)系數(shù)(r)等相關(guān)參數(shù)?？剐员稊?shù)(Rm)=供試種群的LC50/敏感種群的LC50，以LC50的95%置信限是否有重疊作為判斷不同種群間藥劑敏感度差異是否顯著的標(biāo)準(zhǔn)，抗性水平劃分標(biāo)準(zhǔn):＜3 倍為敏感;3-10 倍為低水平抗性;10.1-40 倍為中等抗性;40.1-160 倍為高水平抗性;＞160 倍為極高水平抗性(唐振華和吳士雄，2000)。

1.2 供試藥劑及儀器

90%阿維菌素原粉，深圳瑞德豐有限公司提供。微量點(diǎn)滴儀(0.04-0.05 μL)，南京農(nóng)業(yè)大學(xué)制。RNAiso Reagent、RNA PCR Kit (AMV)Ver3.0、PMD20-T 質(zhì)粒、PMD18-T 質(zhì)粒、Ex-Taq DNA 聚合酶、Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0 和DL2000 等均購自Takara 生物工程有限公司;IPTG、X-gal、Amp 購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。Thermocycler PCR 儀(Bio-Rad);PTC-100 型 PCR 儀 (MJ research);Centrifuge 5180R 冷凍高速離心機(jī) (Effendorf);UVP 凝膠成像系統(tǒng)(Gene);SUB-Cell 電泳儀(Bio-Rad);超靜工作臺(tái)(Holten Lanim);紫外分光光度計(jì)(Beckman);DHP-9052 型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海一恒科技有限公司);HZQ-F160 全溫振蕩培養(yǎng)箱(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)。

1.3 總RNA 提取及cDNA 第一鏈合成

兩品系總RNA 均用RNAiso Reagent 試劑進(jìn)行總RNA 提取，所有操作按試劑盒說明書進(jìn)行，利用RNA PCR Kit (AMV)Ver3.0 試劑盒反轉(zhuǎn)錄mRNA成cDNA 第一鏈，操作均按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.4 PCR 擴(kuò)增反應(yīng)

1.4.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)已報(bào)道并在GeneBank 登錄的地中海實(shí)蠅(登錄號(hào):AF172352)、果 蠅 (登錄號(hào):AY017266)及家蠅(登錄號(hào):AB177547)等編碼GABA 受體基因的保守區(qū)域，以及同源序列氨基酸密碼子的偏好性，設(shè)計(jì)1 對(duì)特異引物克隆編碼桔小實(shí)蠅GABA 受體的5'端cDNA 片段。

上游引物:5'-ATGCCGCGTGCACGTCTCGTC-3'

下游引物:5'-CATAAATCTTTGTTTTCGCATTTG-3'

1.4.2 5'端cDNA 片段雙鏈的合成

反應(yīng)體系(25 μL):1 μL 的cDNA 第一鏈，5 μL的PCR Buffer (5×)，0.125 μL 的Ex-Taq酶(5U)，0.5 μL 的正反引物(25 mM)，17.875 μL的ddH2O。反應(yīng)條件:94℃3 min，94℃30 s，56℃30 s，72℃2 min，35 個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。取5 μL 的DNA，用1.5%瓊脂糖電泳鑒定PCR 產(chǎn)物，紫外線下觀察電泳結(jié)果。

1.5 PCR 產(chǎn)物克隆、測(cè)定及同源性比較

利用Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0試劑盒純化PCR 產(chǎn)物，純化產(chǎn)物經(jīng)連接反應(yīng)連接到pMD20-Tvector 上，再將重組體克隆轉(zhuǎn)化到感受態(tài)大腸桿菌中，通過藍(lán)、白斑篩選將陽性克隆進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)直接委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司測(cè)序，并將測(cè)得的cDNA 片段翻譯成氨基酸序列，用BLAST 軟件進(jìn)行同源性比較和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 敏感與抗性品系的毒力測(cè)定結(jié)果

桔小實(shí)蠅對(duì)阿維菌素的抗性發(fā)展緩慢而穩(wěn)定上升，篩選至27 代時(shí)，抗性倍數(shù)增長(zhǎng)到113.12;抗性上升最快的階段是第21 代至第24 代時(shí)，抗性倍數(shù)從51.76 上升至93.77。從各代次的毒力回歸線的斜率來看，該品系毒力回歸線從平變陡后進(jìn)入較平穩(wěn)狀態(tài)，表明該種群已處于抗性純合子數(shù)量占絕大多數(shù)的階段，群體異質(zhì)性越來越小(表1)。

表1 阿維菌素抗性品系(AvR90)抗藥性測(cè)定結(jié)果Table 1 The resistance results of AvR90strain to avermectin

2.2 編碼GABA 受體基因5'端序列克隆結(jié)果分析

PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳檢測(cè)，獲得與預(yù)期的片段大小相符合的目的帶(如圖1)。經(jīng)純化(圖2)、克隆后測(cè)序，獲得20 條長(zhǎng)度為1053 bp 的5'端cDNA 片段。

2.3 序列分析

通過20 個(gè)單菌落測(cè)序結(jié)果，擴(kuò)增得編碼GABA 受體的5'端cDNA 片段1053 bp (表2)，編碼351 個(gè)氨基酸(表3)。敏感品系SS 與抗性品系A(chǔ)vR90的該cDNA 堿基序列片段有一個(gè)堿基差異，即A496T，但根據(jù)該兩序列推導(dǎo)的氨基酸序列完全相同，因此該堿基突變?yōu)橥x突變。

圖1 編碼桔小實(shí)蠅GABA 受體基因5'cDNA 片段PCR 產(chǎn)物從左至右:AvR90品系;SS 品系;M 為DL2000Fig.1 PCR result of cDNA fragment of encoding GABA receptor gene (Left to right:AvR90strain，SS strain，DL2000)

圖2 編碼桔小實(shí)蠅GABA 受體基因5' cDNA 片段純化從左至右:AvR90品系;SS 品系;M 為DL2000Fig.2 Purified result of cDNA fragment of encoding GABA receptor gene (Left to right:AvR90strain，SS strain，DL2000)

利用NCBI 的Blast 程序進(jìn)行同源分析，結(jié)果顯示克隆獲得的桔小實(shí)蠅敏感品系SS 及抗性品系A(chǔ)vR90的編碼GABA 受體基因的5'端cDNA 片段編碼的氨基酸片段與Genebank 上與其他昆蟲的同源序列具有很高的同源性，其推導(dǎo)的氨基酸序列與地中海實(shí)蠅Ceratitis capitata、家蠅、黑腹果蠅Drosophlia melanogaster Meigen、綠 蠅 Lucilia cuprinaedit、意大利蜜蜂Apis mellifera、稻飛虱Amazona aestiva、小菜蛾等分別有99%、99%、99%、98%、97%、97%、96%同源性。

表2 編碼桔小實(shí)蠅GABA 受體基因的序列片段(1053 bp)Table 2 Partial sequence of encoding GABA receptor gene of B.dorsalis

(續(xù)上表)

表3 編碼桔小實(shí)蠅GABA 受體基因片段推導(dǎo)的氨基酸序列片段Table 3 Partial sequence of amino acid of encoding GABA receptor gene of B.dorsalis

3 結(jié)論與討論

阿維菌素是以GABA 受體為主要靶標(biāo)的一類生物源農(nóng)藥，主要作用于GABA 門控的氯離子通道(潘志萍等，2008)，阿維菌素可刺激突觸前膜大量釋放GABA 促使GABA 門控的氯離子通道持續(xù)開放，大量氯離子涌入膜內(nèi)，造成神經(jīng)膜電位超極化，形成抑制性突觸電位，影響害蟲正常神經(jīng)活動(dòng)，最終導(dǎo)致死亡。其神經(jīng)不敏感性抗性機(jī)制的分子機(jī)理主要有兩方面:GABA 受體數(shù)目的變化和受體的質(zhì)變。Matsumura 等報(bào)道其使蜚蠊抗性品系受體密度顯著減小(Matsumura et al.，1987)。Ffrench-constant 等則發(fā)現(xiàn)GABA 受體的質(zhì)變，其cDNA 處有兩處發(fā)生突變，第995 位的G 突變?yōu)門，1174 位的G 突變?yōu)锳，結(jié)果導(dǎo)致氨基酸序列第302 位丙氨酸變?yōu)榻z氨酸，第361 位的甲硫氨酸變?yōu)楫惲涟彼?，此外大量研究表明許多害蟲抗阿維菌素品系均出現(xiàn)了第302 位丙氨酸突變?yōu)榻z氨酸，這說明害蟲的GABA 受體基因具有高度保守性(Ffrench-Constant et al.，1991;Ffrench-Constant et al.，1993)。

而本文首次獲得編碼桔小實(shí)蠅GABA 受體基因的5'端片段序列1053 bp，經(jīng)序列分析表明抗性品系和敏感品系推導(dǎo)的氨基酸序列完全相同，兩品系編碼GABA 受體基因的該段氨基酸序列沒有存在位點(diǎn)突變，通過比較相似序列而知本文所得的序列的第305 位氨基酸即為編碼GABA 受體基因的保守突變位點(diǎn)，但兩品系該位氨基酸仍為丙氨酸，未發(fā)生突變。因此可推斷抗阿維菌素品系在此抗性倍數(shù)下其抗性產(chǎn)生的原因并不是該保守位點(diǎn)發(fā)生突變的結(jié)果，導(dǎo)致抗性的原因可能是其他因素，如代謝酶活性的變化、GABA 受體數(shù)目的變化或者是編碼GABA 受體序列3'端片段其他位點(diǎn)突變?cè)斐桑绲?61 位的甲硫氨酸突變?yōu)楫惲涟彼?，具體情況還需要進(jìn)一步研究。

References)

Ffrench-Constant RH，Rocheleau TA，et al.A point mutation in a Drosophila GABA receptor confers insecticides resistance ［J］.Nature，1993，363 (3):449-451.

Ffrench-Constant RH，Mortlock DP，Shaffer CD，et al.Molecular cloning and transformation of cyclodiene resistance in Drosophila:An invertebrated GABA receptor locus ［J］.PNAS，1991，88:7209-7213.

Hsu JC，F(xiàn)eng HT，Wu WJ.Resistance and synergistic effects of insecticides in Bactrocera dorsalis (Diptera:Tephritidae) in Taiwan ［J］.Journal of economic entomology，2004，97 (5):1682-1688.

Hsu JC，F(xiàn)eng HT.Insecticide susceptibility of the oriental fruit fly(Bactrocera dorsalis (Hendel))(Diptera:Tephritidae)in Taiwan［J］.Chinese J.Entomol.，2000，20:109-118.

Kaku K，Matsumura F.Identification of the site of mutation within the M2 region of the GABA receptor of the cyclodience resistant german cockroach［J］.Comparative Biochemistry and Physiology Part C:Pharmacology，Toxicology and Endocrinology，1994，108 (3):367-376.

Lasota JA，Dybas RA.Avermectins，a novel class of compounds:implications for use in arthropod pest control ［J］.Annual review of Entomology，1991，36:91-117.

Liang GQ，Liang F，Wu JJ，et al.The study on strategies of Bactrocera dorsalis control ［J］.Guangdong Agriculturl Science，2002，(2):37-40.［梁廣勤，梁帆，吳佳教，等.實(shí)蠅防除策略和措施的研究［J］.廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2002，(2):37-40］

Liu YZ.Study on the oriental fruit fly ［J］.Journal of Entomological Society，1981，16 (1):9-26.［劉玉章.臺(tái)灣東方果實(shí)蠅之研究［J］.興大昆蟲學(xué)會(huì)會(huì)報(bào)，1981，16 (1):9-26］

Lin JT，Zeng L，Lu YY，et al.Advances on biological characteristics and control of Bactrocera dorsalis ［J］.Journal of Zhongkai Agrotechnical College，2004，17 (1):60-67.［林進(jìn)添，曾玲，陸永躍，等.桔小實(shí)蠅生物學(xué)特性及防治研究進(jìn)展［J］.仲愷農(nóng)業(yè)技術(shù)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，17 (1):60-67］

Matsumura F，Tanaka K，Ozoe Y.GABA-related systems as targets for insecticides in“Sites and Action of Neurotoxic Pesticides，ACS Symposium Series 356”［C］.Holling-worth RM，Green MB，eds.American Chemical Society，Washington D.C，1987，44-70.

Pan ZP，Zeng L，Lu YY.Monitoring of resistance of oriental fruit fly adults to insecticides in South China ［J］.Journal of South China Agricultural University，2005，26 (4):23-26.［潘志萍，曾玲，陸永躍.華南地區(qū)桔小實(shí)蠅對(duì)幾種農(nóng)藥的抗藥性研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，26 (4):23-26］

Pan ZP，Lu YY，Zeng L，et al.Development of resistance totrichlorophon，alphamethrin，and avermectin in laboratory populations of the oriental fruit fly，Bactrocera dorsalis (Hendel)(Diptera:Tephritidae)［J］.Acta Entomologica Sinica，2008，51(6):609-617.［潘志萍，陸永躍，曾玲，等.桔小實(shí)蠅實(shí)驗(yàn)種群對(duì)敵百蟲、高效氯氰菊酯和阿維菌素的抗性增長(zhǎng)規(guī)律［J］.昆蟲學(xué)報(bào)，2008，51 (6):609-617］

Pan ZP，Zeng L，Lu YY.Monitoring of resistance of oriental fruit fly adults to insecticides in South China ［J］.Journal of South China Agricultural University，2005，26 (4):23-26.［潘志萍，曾玲，陸永躍.華南地區(qū)桔小實(shí)蠅對(duì)幾種農(nóng)藥的抗藥性研究［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2005，26 (4):23-26］

Tang ZH，Wu SX.Heredity and Evolution of Insect Resistance to Pesticides ［M］.Shanghai:Shanghai Scientific and Technical Literature Publishing House，2000.［唐振華，吳士雄，2000.昆蟲抗藥性的遺傳與進(jìn)化［M］.上?？茖W(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社.2000］

Zhang YP，Zeng L，Lu YY，et al.Monitoring of Insecticide Resistance of Bactrocera dorsalis (Hendel)in South China ［J］.Journal of Huazhong Agricultural University (Natural Science Edition)，2008，27 (4):456-459.［章玉蘋，曾玲，陸永躍，等.華南地區(qū)桔小實(shí)蠅田間種群抗藥性的監(jiān)測(cè)［J］.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2008，27 (4):456-459］

Zhang YP，Zeng L，Lu YY，et al.Monitoring of insecticide resistance of Bactrocera dorsalis adults in South China ［J］.Journal of SouthChina Agricultural University，2007，28 (3):20-23.［章玉蘋，曾玲，陸永躍，等.華南地區(qū)桔小實(shí)蠅抗藥性動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)［J］.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，28 (3):20-23］

Zeng L，Lu YY，Lin JT，et al.Strategies and technical solution of Bactrocera dorsalis control ［C］.The Plant Protection Bulletin，Kunming，Yunnan，2006，11:19-23.［曾玲，陸永躍，林進(jìn)添，等.桔小實(shí)蠅的防治策略和技術(shù).成卓敏主編:中國植物保護(hù)學(xué)會(huì)2006年學(xué)術(shù)年會(huì)“科技創(chuàng)新與綠色植保”［C］.北京:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)技術(shù)出版社.云南昆明，2006，11:19-23］