骨性關(guān)節(jié)炎患者疼痛抑制中TRPM8表達(dá)的臨床意義研究

潘永春 楊朝暉

山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院骨創(chuàng)科，山西太原 030001

骨性關(guān)節(jié)炎（OA）是多發(fā)生于中老年人群的一種退行性關(guān)節(jié)病，主要與軟骨退變、滑膜炎癥等有關(guān)，表現(xiàn)為關(guān)節(jié)疼痛、腫脹等，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。目前臨床上治療OA 常見(jiàn)藥物為透明質(zhì)酸、非甾體抗炎藥等，雖然能有效緩解疼痛及炎癥，但副作用大。眾所周知冰敷等適當(dāng)冷刺激能緩解疼痛（如關(guān)節(jié)痛、偏頭痛等），但過(guò)低則會(huì)加重疼痛或冷覺(jué)過(guò)敏，表明冷覺(jué)和疼痛間存在某種關(guān)聯(lián)，但其作用機(jī)制還不是很了解[1]。隨著分子學(xué)、生物學(xué)的不斷進(jìn)步，部分研究證明TRPs（瞬時(shí)受體電位離子通道）參與機(jī)體溫度感知，而TRPM8（冷覺(jué)感受器受體M8）是TRPs 家族的重要一員，在冷刺激感知上起重要作用[2]。該研究就此于2013年1月—2014年1月通過(guò)骨性關(guān)節(jié)炎小鼠建模試驗(yàn)分析TRPM8表達(dá)在疼痛抑制中的作用。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇32 只成年健康SD 大鼠為研究對(duì)象，鼠齡基本相近，平均體重（300.5±18.5）g，飼養(yǎng)在安靜環(huán)境，不限制其自由活動(dòng)。材料：本研究包括弗氏佐劑、微量注射器針頭、顯微鏡、TRPM8 抗體、薄荷醇等。

1.2 方法

①鞘內(nèi)置管。大鼠腹腔中注射300～350 mg/kg 水合氯醛，將其麻醉后于大鼠枕骨大孔處行縱切口，依次切開(kāi)皮膚、皮下組織后把硬脊膜暴露出來(lái)，將其剪開(kāi)待腦脊液流出后于蛛網(wǎng)膜下置入導(dǎo)管（PE-10 聚乙烯），長(zhǎng)度為7 cm 左右，隨后依次縫合且固定導(dǎo)管，同時(shí)通過(guò)向?qū)Ч苤凶⑸淅嗫ㄒ驒z查其置入是否正確；②骨性關(guān)節(jié)炎大鼠建模。水合氯醛（10%）麻醉后幫助大鼠選擇俯臥位，先用乙醇消毒其右側(cè)外踝附近皮膚，隨后從外踝外側(cè)凹陷部位用胰島素注射器皮下穿刺，隨后轉(zhuǎn)向足尖，刺進(jìn)腓骨、距骨間踝關(guān)節(jié)腔，進(jìn)針深5 mm 左右，加壓后注入50 μL弗氏佐劑，退針后用棉球按壓一會(huì)；③給藥。把大鼠放置到固定器中，從固定器頸部口引出導(dǎo)管，并與胰島素注射器連接，先向?qū)Ч軆?nèi)注入5 μL 生理鹽水，確定導(dǎo)管通常后再注入20 μL試驗(yàn)用藥，隨后再注射一定量的生理鹽水，讓導(dǎo)管內(nèi)藥物完全進(jìn)到鞘內(nèi)。將所有大鼠分為NS-NS 組、CFA-NS 組、CFA-Menthol 組和NS-Menthol 組，各8 只。模型制備后第2 個(gè)星期分別注射薄荷醇或生理鹽水20 μL。薄荷醇劑量為100 ug/kg。用藥前后測(cè)定和記錄各組大鼠抬爪次數(shù)、熱痛敏分?jǐn)?shù)及機(jī)械痛敏闕值等行為學(xué)指標(biāo)。另外用藥后1 個(gè)星期將大鼠處死，將右側(cè)L5DRG 保存在灌注液中，24～48 h 行石蠟包埋處理，制成4 um切片，同時(shí)行免疫組化染色，通過(guò)顯微鏡觀察TRPM8 表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

應(yīng)用SPSS16.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)上述相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，t 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 不同組別大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較

與用藥前比較，CFA-Menthol 組大鼠給藥后大鼠抬爪次數(shù)、熱痛敏分?jǐn)?shù)及機(jī)械痛敏闕值有明顯差異，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。其他組用藥前后指標(biāo)比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見(jiàn)表1。

表1 不同組別大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較（±s,n=8）

表1 不同組別大鼠行為學(xué)指標(biāo)比較（±s,n=8）

注：與給藥前比較，*P＜0.05。

組別NS-NS 組CFA-NS 組CFA-Menthol 組NS-Menthol 組抬爪次數(shù)熱痛敏分?jǐn)?shù)給藥前給藥后給藥前給藥后4.62±0.91 11.01±0.75 10.76±0.70 4.51±0.92 5.02±0.92 11.26±1.05（14.76±0.70）*4.64±1.05 0.87±0.38 7.35±0.27 7.34±0.30 0.85±0.30 1.06±0.31 7.30±0.26（2.65±0.26）*0.98±0.43機(jī)械痛敏闕值給藥前給藥后22.24±0.80 6.71±0.56 6.52±0.44 22.01±0.93 22.10±1.04 6.65±0.65（17.36±0.64）*22.14±1.11

2.2 各組大鼠TRPM8 表達(dá)比較

CFA-NS 組、CFA-Menthol 組大鼠TRPM8 表達(dá)明顯高于NS-NS 組、NS-Menthol 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表2。

表2 各組大鼠TRPM8 表達(dá)比較（±s,n=8）

表2 各組大鼠TRPM8 表達(dá)比較（±s,n=8）

注：與NS-NS 組比較，*P＜0.05。

組別TRPM8 表達(dá)NS-NS 組CFA-NS 組CFA-Menthol 組NS-Menthol 組78.07±3.30 155.85±1.91*157.35±1.47*78.07±2.88

3 討論

3.1 TRPM8 在冷覺(jué)傳導(dǎo)中的作用

相關(guān)離體實(shí)驗(yàn)表明，在DRG（背根神經(jīng)節(jié)）細(xì)胞上可以觀察到冷覺(jué)感受器受體M8 與冷覺(jué)感受器受體V1 共存現(xiàn)象，提示TRPM8 可能參與傷害性冷刺激傳導(dǎo)[3]。相關(guān)研究表明緩激肽、磷脂等炎癥因子都可能激活TRPM8[4]。

冷反應(yīng)的介導(dǎo)主要由C 類(lèi)神經(jīng)纖維及類(lèi)Aδ 負(fù)責(zé)，而這些物質(zhì)能產(chǎn)生一種或多種冷感覺(jué)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明大鼠大部分冷反應(yīng)主要與TRPM8 受體有關(guān)，TRPM8 通過(guò)電流能被26℃以下的溫度激活，包括傷害性冷刺激[5]。但實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)TRPM8 缺陷小鼠對(duì)非傷害性冷刺激感知能力下降，且同時(shí)失去對(duì)傷害性冷刺激的自我保護(hù)行為，另外對(duì)這些小鼠C 類(lèi)神經(jīng)纖維及類(lèi)Aδ 研究發(fā)現(xiàn)冷刺激引發(fā)的行為反應(yīng)明顯減少或者缺失?？梢?jiàn)TRPM8 在冷覺(jué)傳導(dǎo)中起重要作用[6]。

TRPM8 在不同神經(jīng)細(xì)胞亞群中均有表達(dá)，且不同亞群感覺(jué)能力也不一樣，當(dāng)TRPM8 被激活后產(chǎn)生的冷知覺(jué)則由其他機(jī)制影響。Bautista[7]等人研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于缺陷TRPM8 的小鼠模型來(lái)說(shuō)，它們對(duì)15～25℃的感知能力喪失，但卻對(duì)15℃以下的冷溫度有一定的逃避能力，這提示TRPM8 的主要作用是參與非傷害性冷刺激及部分傷害性冷刺激，這從側(cè)面反映除了TRPM8 傳導(dǎo)冷刺激外，還有其他作用機(jī)制，特別是對(duì)傷害性冷刺激起傳導(dǎo)作用。

3.2 TRPM8 在疼痛抑制中的可能機(jī)制

神經(jīng)元亞群中若含有C 類(lèi)神經(jīng)纖維及類(lèi)Aδ，則可能對(duì)15～30℃、15℃以下的溫度產(chǎn)生行為反應(yīng)。相關(guān)研究表明慢性疼痛大鼠機(jī)體TRPM8（陽(yáng)性C 纖維、陽(yáng)性Aδ 纖維）上調(diào)，則表明TRPM8表達(dá)可能通過(guò)參與薄荷醇起鎮(zhèn)痛效果[8]。Produfoot等[9]人研究發(fā)現(xiàn)皮膚溫度下降到16℃、薄荷醇或icilin 等對(duì)TRPM8 受體產(chǎn)生刺激作用，導(dǎo)致其參與到神經(jīng)病理性疼痛大鼠鎮(zhèn)痛過(guò)程，且該鎮(zhèn)痛效果無(wú)法被納洛酮拮抗，表明TRPM8 抑制疼痛的作用原理和傳統(tǒng)阿片鎮(zhèn)痛沒(méi)有關(guān)聯(lián)。但研究發(fā)現(xiàn)該鎮(zhèn)痛效果卻可以被II/III mGluRs 拮抗劑選擇性的逆轉(zhuǎn)，表明TRPM8 激活后鎮(zhèn)痛作用主要由中樞介導(dǎo)，且依賴(lài)于II/III mGluRs。這是因?yàn)镮I mGluRs 在初級(jí)傳入感覺(jué)神經(jīng)通路突觸前、突觸后中比較常見(jiàn)，而III mGluRs絕大部分分布在突觸前，將II/III mGluRs 激活后便可對(duì)脊髓背角傳入神經(jīng)引發(fā)的電位變化起抑制作用。相關(guān)文獻(xiàn)表明培養(yǎng)基與切片脊髓背角、DRG 的某些突觸，給予薄荷醇補(bǔ)充后能提高突觸后電位（興奮性）頻率，這和TRPM8 表達(dá)陽(yáng)性傳入神經(jīng)激活，釋放出大量的谷氨酸一致[10]。骨性關(guān)節(jié)炎病發(fā)后TRPM8 介導(dǎo)鎮(zhèn)痛作用機(jī)制為：TRPM8 陽(yáng)性表達(dá)傳導(dǎo)到神經(jīng)纖維中，釋放出一定量的葡萄糖（Glu），介導(dǎo)ivilin 后達(dá)到鎮(zhèn)痛的目的，其機(jī)制為激活傷害性傳入纖維突觸前或突觸后II/III mGluRs，進(jìn)而使疼痛相關(guān)神經(jīng)損傷緩解引起。

薄荷醇具有清涼作用，可用于醫(yī)用刺激藥，外用有清涼止癢功效，內(nèi)服可止痛，適用于頭痛、咽喉痛等疾病。從表1 可知，CFA-Menthol 組大鼠給藥前后大鼠抬爪次數(shù)、熱痛敏分?jǐn)?shù)及機(jī)械痛敏闕值比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。表明薄荷醇的止痛作用。且表2 中，CFA-NS 組、CFA-Menthol 組大鼠TRPM8 表達(dá)明明顯比NS-NS 組、NS-Menthol 組高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），從側(cè)面表明TRPM8 可以有效被薄荷醇激活，發(fā)揮其疼痛抑制作用。

另外，TRPM8 不僅可以被薄荷醇、icilin 激活，而且還受pH值影響，當(dāng)pH 值在6 以下時(shí)，TRPM8 對(duì)冷刺激反應(yīng)完成消失；當(dāng)pH 值在6.5～8.1 之間時(shí)，TRPM8 激活溫度在15～27℃之間。同時(shí)細(xì)胞內(nèi)pH 值變化對(duì)TRPM8 激活能力影響比較大，當(dāng)pH 值增加到7.4 時(shí)，icilin 激活TRPM8 能力較之前提高4 倍；當(dāng)pH 值下降到6.5 時(shí)，icilin 激活TRPM8 能力則明顯下降。但pH 值變化對(duì)薄荷醇激活TRPM8 的能力基本沒(méi)有影響，當(dāng)icilin 失去TRPM8 激活能力后，薄荷醇還是可以激活TRPM8，提示TRPM8激活機(jī)制在兩種及以上，但具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，TRPM8 表達(dá)主要作用是監(jiān)測(cè)冷刺激，促成損傷后冷覺(jué)過(guò)敏以鎮(zhèn)痛。薄荷醇不僅具有鎮(zhèn)痛作用，而且還可以激活TRPM8 受體加強(qiáng)冷覺(jué)過(guò)敏，以充分發(fā)揮冷鎮(zhèn)痛效果，但TRPM8在骨性關(guān)節(jié)炎疼痛抑制中的作用機(jī)制需進(jìn)一步研究。

[1]曹燕卿.低溫對(duì)大鼠真皮微血管內(nèi)皮細(xì)胞的影響及TRPM8 參與調(diào)控的機(jī)制[D].北京：中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院，2013.

[2]蘇林,王國(guó)林.TRPM8 與神經(jīng)病理性疼痛[J].國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志,2011,32(1):96-100.

[3]秦冬梅,李晶,歐陽(yáng)穎，等.TRPM8 離子通道在偏頭痛發(fā)生中的作用[J].實(shí)用疼痛學(xué)雜志,2012,8(6):456-459.

[4]馬洪明,劉升明,陳萬(wàn)群.哮喘小鼠肺組織TRPM8 與TRPA1mRNA 的表達(dá)[J].廣東醫(yī)學(xué),2012,33(6)：750-752.

[5]劉祥鵬.TRPM8 在慢性非細(xì)菌性前列腺炎SD 大鼠前列腺組織的表達(dá)及意義[D].合肥：安徽醫(yī)科大學(xué),2012.

[6]蘇林,王國(guó)林.TRPM8 與神經(jīng)病理性疼痛[J].國(guó)際麻醉學(xué)與復(fù)蘇雜志,2011,32(1)：96-100.

[7]ProudfootCJ,GarryEM,CottrellDF,et al.Analgesia mediated by the TRPM8 cold receptor in chronic neuropathic pain[J].Curr Biol,2006,16(16):1591-605.

[8]李敏超,Juliy M,Perelman,Victor P,Kolosov,等.瞬時(shí)受體電位M8 離子通道對(duì)冷刺激誘導(dǎo)氣道上皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響[J].中華結(jié)核和呼吸雜志,2011,34(10)：757-761.

[9]BautistaDM,SiemensJ,GlazerJM,et al.The menthol receptor TRPM8 is the principal detector of environmental cold[J].Nature,2007,448(7150):204-208.

[10]任永穎,王超,王國(guó)林.關(guān)節(jié)炎大鼠背根神經(jīng)節(jié)TRPM8 在冷覺(jué)過(guò)敏形成中的作用[J].山東醫(yī)藥,2010,50(19)：42-44.