熒光原位雜交法觀察小鼠皮膚組織切片中型無綠藻感染的研究

康俞莉 趙穎 章強(qiáng)強(qiáng)

熒光原位雜交法觀察小鼠皮膚組織切片中型無綠藻感染的研究

康俞莉 趙穎 章強(qiáng)強(qiáng)

目的探討熒光原位雜交技術(shù)用于診斷小鼠皮膚中型無綠藻感染模型的可行性。方法制作小鼠皮膚中型無綠藻感染模型，制備皮膚組織石蠟切片，用人工合成的探針PZ-probe進(jìn)行熒光原位雜交檢測，以過碘酸錫夫(PAS)染色、HE染色做陽性對照；取正常及其他真菌感染的皮膚組織石蠟切片做陰性對照，以同樣的方法進(jìn)行熒光原位雜交檢測，將各種檢測方法的結(jié)果進(jìn)行對比分析。結(jié)果小鼠臨床體征、病理檢測及病原體培養(yǎng)結(jié)果均證實(shí)皮膚無綠藻感染模型建立成功。通過熒光原位雜交法成功檢測出了小鼠皮膚中型無綠藻感染模型皮膚組織中的無綠藻病原體，結(jié)果與PAS染色和HE染色一致；而在正常及其他真菌感染的皮膚組織石蠟切片中均未能檢測出無綠藻。結(jié)論熒光原位雜交法可以檢測出小鼠皮膚中型無綠藻感染模型組織石蠟切片中的無綠藻病原體。

原壁菌屬；皮膚；原位雜交，熒光；小鼠

無綠藻(Prototheca)是一種直徑約3～30 μm的單細(xì)胞生物，廣泛存在于自然界和動物體表及體內(nèi)，是一種機(jī)會致病菌[1-2]。皮膚無綠藻病是由無綠藻感染導(dǎo)致的一種皮膚真菌病，也是無綠藻病最常見的類型，約占全球無綠藻病例報(bào)道的一半以上。其皮損表現(xiàn)多樣，四肢與面部多發(fā)，呈局限性，多與創(chuàng)傷后病原菌侵入有關(guān)，有細(xì)胞免疫缺陷者損害易播散[3-5]。因皮膚無綠藻病無特異性臨床表現(xiàn)，故診斷困難。目前雖然可以通過直接鏡檢、真菌培養(yǎng)、組織病理學(xué)、PCR等手段對皮膚無綠藻病進(jìn)行鑒定和診斷，但是這些方法都有其局限性，因此需要探索更好的方法提高對皮膚無綠藻病的早期診斷率。

材料和方法

一、菌株

上海復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科真菌室提供無綠藻菌株，分離自1例皮膚無綠藻病患者皮損，經(jīng)形態(tài)學(xué)及分子生物學(xué)鑒定為中型無綠藻波多黎各變種[6]，已收藏入美國菌種保藏中心(American Type Culture Collection，ATCC)， 編 號 為 ATCC MYA-4789。取適量菌種接種于沙氏液體培養(yǎng)基，28℃恒溫培養(yǎng)。

二、小鼠皮膚中型無綠藻感染模型的制作和標(biāo)本采集

BALB/c雄性小鼠20只，SPF級，6～8周齡，18～22 g，購于復(fù)旦大學(xué)上海醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物研究中心[許可證編號:SYXK(滬)2009-0082]。參照小鼠皮膚無綠藻感染模型的建立方法[7]，每只小鼠經(jīng)腹部皮下多點(diǎn)接種1×109cfu/ml中型無綠藻菌懸液200 μl。7 d后處死小鼠，無菌條件下取其腹部皮膚，分別進(jìn)行真菌鏡檢、培養(yǎng)和4%甲醛固定、石蠟包埋、4 μm厚連續(xù)切片，置于防脫載玻片上，以熒光原位雜交法(FISH)檢測無綠藻，同時分別行PAS、HE染色，鏡下觀察無綠藻的形態(tài)特征，作為FISH檢測的陽性對照。另外收集正常小鼠皮膚標(biāo)本3例，收集其他真菌小鼠皮膚感染標(biāo)本6例(其中白念珠菌感染標(biāo)本3例，新生隱球菌感染標(biāo)本3例)，分別行PAS染色、HE染色及FISH檢測作陰性對照。

三、探針制備

從基因庫中下載所有無綠藻菌株及相鄰種屬代表性菌株的SSU rDNA序列，用Genious(5.65)軟件進(jìn)行序列比對，鑒定無綠藻屬特有的序列區(qū)域；針對這些特異性序列，用Primer express 5.0進(jìn)行探針設(shè)計(jì)。美國Invitrogen公司合成寡核苷酸探針PZ-probe:5'-CGACGACTCTCCCAACCCGCG-3'，F(xiàn)ITC熒光標(biāo)記，并置于-20℃避光保存。用純中型無綠藻懸液制成涂片，檢驗(yàn)探針是否有效。將探針稀釋至50 μmol/L，分裝備用。

四、FISH檢測

[8]，方法簡述如下:①脫蠟:石蠟切片經(jīng)常規(guī)二甲苯脫蠟3次，每次5 min，100%乙醇脫蠟2次，每次3 min；②破壁:60℃預(yù)熱的十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)溶液，水浴20 min；③變性:80℃立式染缸預(yù)熱，變性6 min，即移入預(yù)冷的70%、80%、100%乙醇內(nèi)，每缸2 min，空氣干燥；④雜交:準(zhǔn)備探針，滴10 μl探針在組織上，終濃度為1 μmol/L(共20例標(biāo)本)，加蓋玻片，膠水密封，37℃黑暗濕盒孵育6 h；⑤雜交后水洗，去除膠水和蓋玻片，常溫下2×SSC洗滌液中洗滌2次，每次3 min，梯度乙醇脫水，空氣干燥；⑥在雜交區(qū)加入 10 μl 4'，6-二脒基-2-苯基吲哚襯染細(xì)胞，蓋上蓋玻片，在Olympus熒光顯微鏡下觀察、拍照，應(yīng)用Photoshop CS 9.0軟件進(jìn)行圖片處理。自步驟④開始均需避光操作。陽性對照和陰性對照同上述方法作FISH檢測。

結(jié) 果

一、小鼠皮膚中型無綠藻感染模型

肉眼觀察20只小鼠，接種無綠藻處均出現(xiàn)丘疹、膿腫，部分出現(xiàn)潰瘍、結(jié)痂(圖1)，皮損直接鏡檢可見大小不一的抱子囊，內(nèi)含數(shù)個無色透明的內(nèi)生抱子(圖2)。挑取小鼠皮損處分泌物，接種在沙氏培養(yǎng)基上，待單一菌落生長后，挑取典型菌落轉(zhuǎn)接，采用劃線分離法反復(fù)直至獲得純培養(yǎng)體，再接種于沙氏培養(yǎng)基上，7 d后可見白色奶油樣、酵母樣菌落，表面光滑，為無綠藻生長(圖3)。根據(jù)小鼠臨床體征、病理檢測及病原體培養(yǎng)結(jié)果，小鼠皮膚中型無綠藻感染模型建立成功。

二、PAS、HE 染色結(jié)果

圖1 小鼠皮膚中型無綠藻感染模型皮損大體觀察:每只小鼠經(jīng)腹部皮下多點(diǎn)接種1×109cfu/ml中型無綠藻菌懸液200 μl，7 d后觀察，小鼠腹部皮膚表現(xiàn)為局部膿性丘疹，表面有破潰，結(jié)痂 圖2 小鼠皮膚中型無綠藻感染模型，腹部皮損組織直接鏡檢觀察?？梢姶笮〔灰坏谋ё幽?，內(nèi)含數(shù)個無色透明的內(nèi)生抱子(箭頭)，無菌絲(×400) 圖3 挑取小鼠皮損處分泌物，經(jīng)反復(fù)分離獲得純培養(yǎng)體后，接種在沙氏培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d，可見白色奶油樣、酵母樣菌落，表面光滑，為無綠藻生長的典型表現(xiàn)

20例小鼠皮膚中型無綠藻感染模型皮膚組織石蠟切片經(jīng)PAS染色均可見無綠藻呈圓形、卵圓形、橢圓形，內(nèi)含數(shù)個厚壁內(nèi)抱子，不出芽(圖4a)。PAS染色可清楚地檢測出白念珠菌及新生隱球菌(圖4b，4c)。15例小鼠皮膚中型無綠藻感染模型皮膚組織石蠟切片經(jīng)HE染色可見典型無綠藻(圖5a)。HE染色可檢測出白念珠菌及新生隱球菌(圖5b，5c)。根據(jù)病理檢測結(jié)果，無綠藻、白念珠菌、新生隱球菌三者形態(tài)完全不同(圖4，5)。

圖4 小鼠皮膚真菌感染模型皮損組織病理(PAS染色×1 000，標(biāo)尺20 μm) 4a:無綠藻，可見真皮組織無綠藻表現(xiàn)為圓形及橢圓形的內(nèi)含內(nèi)抱子的厚壁抱子囊，不出芽(箭頭)；4b:白念珠菌(箭頭)；4c:新生隱球菌(箭頭) 圖5 小鼠皮膚真菌感染模型皮損組織病理(HE×1 000，標(biāo)尺20 μm) 5a:無綠藻，真皮層可見大量抱子，周圍淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤，無綠藻的內(nèi)抱子清晰可見，呈分葉狀(箭頭)；5b:白念珠菌(箭頭)；5c:新生隱球菌(箭頭)

三、FISH檢測結(jié)果

通過標(biāo)記純培養(yǎng)的中型無綠藻檢測DNA探針的效果，結(jié)果提示該探針可完全標(biāo)記中型無綠藻(圖6)。20例小鼠皮膚中型無綠藻感染皮膚組織石蠟切片中，18例經(jīng)FISH檢測顯示綠色顆粒狀雜交信號，呈局灶性或散在分布，信號較強(qiáng)，易與背景區(qū)分，可確定為無綠藻病原體(圖7)；9例陰性對照小鼠皮膚組織石蠟切片未檢出熒光信號。PAS、HE、FISH 3種方法診斷小鼠皮膚中型無綠藻模型的結(jié)果統(tǒng)計(jì)見表1。

表1 3種方法診斷小鼠皮膚中型無綠藻感染的結(jié)果(例)

討 論

圖6 DNA探針標(biāo)記純培養(yǎng)的中型無綠藻，結(jié)果顯示無綠藻可被設(shè)計(jì)的探針標(biāo)記(×1 000，標(biāo)尺20 μm) 圖7 小鼠皮膚中型無綠藻感染皮損組織石蠟切片探針檢測(×1 000，標(biāo)尺20 μm) 7a:呈卵圓形的綠色亮點(diǎn)即為無綠藻；7b:藍(lán)色為4'，6-二脒基-2-苯基吲哚

無綠藻病的診斷目前主要依靠直接鏡檢、真菌培養(yǎng)、組織病理學(xué)等手段對無綠藻進(jìn)行鑒定。皮膚無綠藻感染的組織病理學(xué)檢測可見桑葚樣、草莓樣抱子囊，內(nèi)含數(shù)個厚壁內(nèi)抱子，不出芽，PAS染色可清晰分辨病原菌的形態(tài)與結(jié)構(gòu)，嗜銀染色及免疫熒光亦可顯色[9]。但某些真菌在組織中的形態(tài)與無綠藻相似，因此單純用組織病理學(xué)難以確診無綠藻病。真菌培養(yǎng)是明確診斷的最好辦法，但其周期太長，往往需要1～2周，可能耽誤患者病情，一些已送檢的標(biāo)本也常因體外生長條件不適合而無法培養(yǎng)出致病菌，導(dǎo)致假陰性[10]。近年來，PCR技術(shù)已成功用于檢測真菌，但需要用物理液氮研磨的方法破碎細(xì)胞壁，提取DNA，其操作過程太過復(fù)雜[11]。由于上述常規(guī)手段在診斷無綠藻等真菌感染性疾病方面均存在敏感性低、周期長、操作復(fù)雜等不足，因此需要探索更好的方法。

FISH技術(shù)是在已有的放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性DNA分子原位雜交技術(shù)。它利用熒光標(biāo)記的核酸片段做探針，與染色體上或DNA顯微切片上的目標(biāo)DNA序列特異性雜交，通過熒光檢測系統(tǒng)(熒光顯微鏡)檢測信號DNA序列在染色體或DNA顯微切片上的表達(dá)，進(jìn)而確定其雜交位點(diǎn)[12]。熒光標(biāo)記探針不會對環(huán)境造成污染，靈敏度高，可進(jìn)行多色觀察分析，因而可同時使用多個探針，縮短因單個探針分開使用導(dǎo)致的周期長、過程復(fù)雜和技術(shù)障礙，可以在細(xì)胞標(biāo)本或組織標(biāo)本上進(jìn)行。在FISH檢測中，如何提高寡核苷酸探針透過細(xì)胞壁/膜進(jìn)入細(xì)胞的效率是一個難點(diǎn)。已有研究證實(shí)，寡核苷酸探針通過疏水作用或者靜電吸引作用，可穿透被CTAB包被的細(xì)胞壁，因此CTAB可以提高探針的穿透力。在本次研究中，我們使用CTAB包被無綠藻，提高了DNA探針進(jìn)入無綠藻的穿透力，保證了實(shí)驗(yàn)的順利進(jìn)行。

與其他常規(guī)方法諸如，直接鏡檢、真菌培養(yǎng)、組織病理、PCR等比較，F(xiàn)ISH具有以下特點(diǎn):①所需時間短，一旦條件摸索成熟、方法建立，1 h內(nèi)即可診斷，達(dá)到快速診斷的目的；②明顯提高檢測的陽性率，即使真菌培養(yǎng)和PAS染色均為陰性，也可檢測出是否含有無綠藻；③無需提取DNA，可通過探針上所標(biāo)記的檢測系統(tǒng)將其在核酸的原有位置上顯示出來，更直觀地觀察到無綠藻所在的部位；④在DNA分子的水平上進(jìn)行雜交，不僅可以診斷出無綠藻的種屬，也能也可用種特異性探針，直接鑒定到其種級水平；⑤可利用存放多年的石蠟切片；⑥實(shí)驗(yàn)所需用切片標(biāo)本量少，不影響蠟塊的保存和重復(fù)使用。

綜上所述，本研究突破了常規(guī)真菌檢測方法的局限性，設(shè)計(jì)中型無綠藻特異性DNA探針，首次嘗試將FISH用于檢測皮膚組織石蠟切片中的無綠藻感染，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與PAS、HE染色檢測結(jié)果一致。此技術(shù)為臨床快速、準(zhǔn)確診斷皮膚無綠藻病提供了新的方法。

參考文獻(xiàn)

[1]Lass-Florl C，Mayr A.Human protothecosis[J].Clin Microbiol Rev，2007，20(2)：230-242.

[2]章強(qiáng)強(qiáng).中國無綠藻病發(fā)病的現(xiàn)狀分析及其診治[J].實(shí)用皮膚病學(xué)雜志，2013，6(2)：65-67.

[3]Todd JR，King JW，Oberle A，et al.Protothecosis：report of a case with 20-year follow-up，and review of previously published cases[J].Med Mycol，2012，50(7)：673-689.

[4]Zhang QQ，Li L，Zhu LP，et al.Cutaneous protothecosis in patient with diabetes mellitus and review of published case reports[J].Mycopathologia，2012，173(2-3)：163-171.

[5]Lu S，Xi L，Qin W，et al.Cutaneous protothecosis：two new cases in China and literature review[J].Int J Dermatol，2012，51(3)：328-331.

[6]Zhang Q，Weng X，Li L，et al.An unusual case of granulomatous lymphadenitis due toPrototheca zopfiivar.portoricensis in an immunocompetent man in China[J].Int J Infect Dis，2010，14(Suppl 3)：e32-e355.

[7]曾義斌，趙穎，章強(qiáng)強(qiáng).無綠藻感染小鼠皮膚模型的構(gòu)建[J].中華皮膚科雜志，2013，46(10)：746-748.

[8]馬蕾，李若瑜.應(yīng)用種特異性探針原位雜交技術(shù)檢測系統(tǒng)性曲霉感染[J].中華皮膚科雜志，2002，35(2)：128-130.

[9]李若瑜.應(yīng)用現(xiàn)代化診斷方法提高我國真菌病診斷水平[J].中華檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2008，31(2)：125-127.

[10]呂雪蓮，劉澤虎，梅亞寧，等.二次用于臨床標(biāo)本真菌感染快速分子診斷的研究[J].中華皮膚科雜志，2009，42(6)：390-392.

[11]趙婷婷.熒光原位雜交技術(shù)的發(fā)展與應(yīng)用[J].生命科學(xué)儀器，2008，6(7)：38-41.

[12]Ueno R.Visualization of sporopollenin-containing pathogenic green micro-algaPrototheca wickerhamiiby fluorescent in situ hybridization(FISH)[J].Can J Microbiol，2009，55(4)：465-472.

2013-12-11)

(本文編輯:吳曉初)

Detection ofPrototheca zopfiiinfection in mouse skin tissue sections by using fluorescencein situ hybridization

Kang Yuli，Zhao Ying，Zhang Qiangqiang.Department of Dermatology，Huashan Hospital，F(xiàn)udan University，Shanghai 200040，China

Zhang Qiangqiang，Email：zhangqq8@163.com

ObjectiveTo evaluate the feasibility to detectProtothecain a mouse model ofPrototheca zopfiicutaneous infection by using fluorescencein situhybridization(FISH).MethodsThe model ofPrototheca zopfiicutaneous infection was established by abdominal subcutaneous inoculation ofPrototheca zopfiisuspensions into 20 male BALB/c mice.Seven days after the inoculation，the mice were sacrificed，and tissue specimens were obtained from abdominal skin and subjected to microscopic examination，fungal culture and paraffin embedding.A PZ-probe was artificially synthesized and used to detectProtothecain paraffin-embedded sections by using FISH.Moreover，both periodic acid-Schiff(PAS)and hematoxylin-eosin(HE)staining were performed to examine the paraffinembedded sections.Skin specimens obtained from normal mice andCandida albicans-orCryptococcus neoformansinfected mice served as the negative control.ResultsClinical presentations，pathological examination and fungal culture results all confirmed the successful establishment ofPrototheca zopfiiskin infection model in mice.Protothecawas identified by FISH with the PZ-probe in the paraffin-embedded skin tissue sections from the murine model ofPrototheca zopfiicutaneous infection，but not detected in the negative control tissue specimens，which was consistent with the results of PAS and HE staining.ConclusionFISH can be used to detectProtothecain paraffinembedded skin sections from the mouse model ofPrototheca zopfiicutaneous infection.

Prototheca；Skin；In situhybridization，fluorescence；Mice

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.09.010

200040上海，復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科

章強(qiáng)強(qiáng)，Email:zhangqq8@163.com