嗎啡和曲馬多對MADB-106乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響

劉紅軍，朱紅梅，程祝強，金 毅，徐建國

嗎啡是腫瘤患者術(shù)后鎮(zhèn)痛和癌痛治療常用藥物，研究表明嗎啡在鎮(zhèn)痛同時可對腫瘤細胞的生長和轉(zhuǎn)移產(chǎn)生影響，其機制可能與抑制自然殺傷細胞(natural killer cell，NK)活性等有關［1-4］。鑒于嗎啡具有免疫抑制作用，許多其他藥物亦被用于替代嗎啡鎮(zhèn)痛。其中曲馬多由于鎮(zhèn)痛效果好，不良反應小而被廣泛使用［5］。有研究［5-6］認為，等效鎮(zhèn)痛劑量的曲馬多和嗎啡相比，可有效減輕手術(shù)應激和疼痛所致的免疫抑制，并且曲馬多不會對細胞免疫功能產(chǎn)生抑制作用，相反可增強NK細胞活性和促進白細胞介素-2(IL-2)的產(chǎn)生。但腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移除了機體抗腫瘤免疫機制的間接作用外，還與腫瘤細胞自身的生長增殖能力有關。既往研究表明嗎啡可與細胞表面阿片受體結(jié)合，調(diào)節(jié)細胞的生長，但具體機制仍不清楚［7-8］;關于曲馬多對腫瘤細胞增增殖和凋亡的影響尚無研究。因此本研究擬通過離體實驗，研究等效鎮(zhèn)痛劑量嗎啡和曲馬多對腫瘤細胞增殖和凋亡的影響，并對其機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 實驗試劑與器材 硫酸嗎啡、β-Actin鼠源單抗(美國Sigama公司);曲馬多(德國格蘭泰有限公司);大鼠乳腺癌細胞系 MADB106(上海通派生物科技有限公司);Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒、RPMI-1640(美國GIBCO公司);FBS(美國ExCell Biology公司);MTT(美國Amresco公司);96孔、24孔與6孔細胞培養(yǎng)板(美國Corning Incorporated公司);半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)抗體、半胱氨酸蛋白酶-8(caspase-8)抗體、激活型caspase-3抗體、激活型caspase-8抗體(美國Cellsignaling公司)。圖像分析軟件Image J(NIH公司);垂直電泳槽(Bio-Rad公司);超凈工作臺(中國蘇州凈化 SW-CJ-1FD);CO2培養(yǎng)箱(日本SANYO公司);EL-x800酶標儀(美國BioTek公司);流式細胞儀(美國Becton-Dickinson公司)。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組 MADB-106乳腺癌細胞株經(jīng)含10%胎牛血清的RPMI-1640完全培養(yǎng)基在37℃，濕度為95%，體積分數(shù)為5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。組別:空白對照組，溶劑對照組，嗎啡Ⅰ組(1 nM)，嗎啡Ⅱ組(1 μM)，嗎啡Ⅲ組(1 mM)，曲馬多Ⅰ組(10 nM)，曲馬多Ⅱ組(10 μM)，曲馬多Ⅲ組(10 mM)。

1.2.2 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡將濃度為5×105個/mL MADB-106乳腺癌細胞消化接種到六孔板中，待細胞貼壁后，根據(jù)實驗分組分別加入相應的含藥培養(yǎng)基，同時設立陰性對照組;藥物作用24 h后，用0.25%胰酶(不含EDTA)消化收集、洗滌細胞，各組分別加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加入 5 μL Propidium Iodide，混勻;室溫、避光、反應5～15 min;用流式細胞儀檢測各組細胞凋亡情況。

1.2.3 MTT法檢測細胞增殖 將細胞消化、計數(shù)、配制成濃度為5×104個/mL的細胞懸液，96孔細胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL細胞懸液，培養(yǎng)24 h后洗滌細胞兩次。用完全培養(yǎng)基稀釋嗎啡和曲馬多至所需濃度，每孔加入200 μL相應的含藥培養(yǎng)基，將96孔細胞培養(yǎng)板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h;將96孔板進行MTT染色，采用酶標儀測定吸光度值(OD值)，λ=490 nm，計算不同濃度嗎啡和曲馬多對腫瘤細胞的抑制率及藥物半抑制濃度(IC50)［9］。

抑制率(%)=(陰性對照組－實驗組)/陰性對照組×100%。

1.2.4 Western blot法檢測 caspase-3 和 caspase-8表達 每1×106細胞加入50 μL細胞溶解緩沖液，充分裂解細胞，離心取上清液，按說明書操作，加入各類相關試劑。內(nèi)參為β-Actin(1∶1000)，測定條帶灰度值，以目的條帶灰度值與內(nèi)參灰度值的比值反映caspase-3、caspase-8、激活型 caspase-3和激活型caspase-8的表達水平。

1.3 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Bonferroni法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。以機率單位加權(quán)回歸法(Bliss法)計算IC50。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度嗎啡和曲馬多對腫瘤細胞凋亡的影響 Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測結(jié)果表明，不同濃度的嗎啡和曲馬多與腫瘤細胞直接作用24 h后，劑量依賴性誘導腫瘤細胞凋亡(圖1)。由表1可知，等效鎮(zhèn)痛濃度的嗎啡與曲馬多并無差異(P ＞0.05)。

圖1 流式檢測不同濃度嗎啡和曲馬多對腫瘤細胞凋亡的影響

表1 各組細胞凋亡率

2.2 不同濃度嗎啡和曲馬多對腫瘤細胞增殖的影響 見表2。結(jié)果顯示嗎啡與曲馬多均濃度依賴性抑制腫瘤細胞的增殖。嗎啡抑制腫瘤細胞增殖的IC50為11.3 mM，曲馬多抑制腫瘤細胞增殖的IC50為31.3 mM。

表2 MTT檢測不同濃度嗎啡和曲馬多對腫瘤細胞增殖的影響

2.3 各組caspase-3和caspase-8表達變化 嗎啡1 mM和曲馬多10 mM分別與腫瘤細胞作用24 h后各組總的caspase-3和caspase-8蛋白表達無明顯差異，而二者的激活片段則出現(xiàn)了顯著的改變，嗎啡組和曲馬多組caspase-3激活片段表達均增加(表3，P＜0.05)，但caspase-8激活片段僅嗎啡組表達增高，曲馬多組無明顯變化。

表3 各組caspase-3和caspase-8表達變化(%，±s)

表3 各組caspase-3和caspase-8表達變化(%，±s)

注:與空白對照組和溶劑對照組比較，*P＜0.05

caspase-8空白對照組組別 激活型caspase-3 激活型0.33 ±0.02 0.24 ±0.02溶劑對照組 0.36 ±0.02 0.28 ±0.01嗎啡1 mM 0.68 ±0.03* 0.49 ±0.03*曲馬多 10 mM 0.67 ±0.01*0.27 ±0.02

3 討論

腫瘤細胞的增殖和凋亡對腫瘤的發(fā)生、發(fā)展以及預后和復發(fā)具有重要意義。本研究體外細胞實驗結(jié)果表明嗎啡和曲馬多均可濃度依賴性抑制腫瘤細胞的生長，促進細胞的凋亡，這與以前研究［12-15］相一致。但本研究結(jié)果與前研究［13-14］也有所不同，筆者發(fā)現(xiàn)1 nM嗎啡即可促進MADB-106乳腺癌細胞的凋亡，等效鎮(zhèn)痛濃度的曲馬多同樣可促進細胞凋亡。而Tegeder等［10］研究認為高濃度的嗎啡(＞10 μM)可顯著抑制MCF-7和MDA-MB-231腫瘤細胞的生長。

盡管進行了大量的研究，但嗎啡等阿片類藥物調(diào)節(jié)腫瘤細胞增殖和凋亡的具體機制仍不清楚。阿片受體不僅在外周神經(jīng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達，在許多正常細胞和腫瘤細胞表面同樣存在［1，11］。嗎啡可與細胞表面阿片受體結(jié)合，從而調(diào)節(jié)細胞的生長。其機制包括絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)、C-Jun氨基末端激酶的激活，活性氧、NO的產(chǎn)生，促凋亡的Bim表達增加，抗凋亡的Bcl-2表達降低以及p53、NF-κB介導的細胞信號通路等［12-15］。曲馬多則具有雙重鎮(zhèn)痛機制，一方面可與μ受體結(jié)合，另一方面可激活中樞單胺能系統(tǒng)，抑制5-羥色胺(5-HT)和去甲腎上腺素的攝取。本研究結(jié)果表明曲馬多和嗎啡一樣，同樣可濃度依賴性抑制腫瘤細胞的增殖，促進細胞的凋亡，并且等效鎮(zhèn)痛濃度的嗎啡與曲馬多并無差異。既往研究認為不僅僅是阿片受體還有其他受體系統(tǒng)參與腫瘤細胞增殖，如生長抑素受體、阿片與煙堿和雌激素信號途徑的相互作用等［16-17］。因此筆者推測曲馬多調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖與凋亡的機制除了與μ受體作用以外，中樞單胺能系統(tǒng)同樣在其中發(fā)揮重要作用。

嗎啡與阿片受體結(jié)合后通過下游何種信號途徑最終產(chǎn)生細胞凋亡尚不清楚。盡管目前對凋亡過程的詳細機制尚不完全清楚，但是已經(jīng)確定半胱氨酸蛋白酶(caspase)在凋亡過程中是起著至關重要作用［18］。目前主要的細胞凋亡通路均與caspase激活有關。細胞凋亡的過程即是caspase不可逆水解底物的級聯(lián)放大反應過程。參與誘導凋亡的caspase分成兩大類:啟動酶和效應酶，它們分別在凋亡信號轉(zhuǎn)導的上游和下游發(fā)揮作用。啟動caspase包括啟動caspase-8，9，10。啟動 caspase可發(fā)生同源活化，在細胞凋亡過程中最早發(fā)生。啟動caspase活化后，即開啟細胞內(nèi)的死亡程序，通過異源活化方式水解下游caspase將凋亡信號放大，同時將死亡信號向下傳遞。被異源活化的caspase即效應caspase，包括caspase-3，6，7。本 研 究 結(jié) 果 表 明 caspase-3 和caspase-8信號通路參與了嗎啡誘導的乳腺癌細胞的凋亡。這與既往研究結(jié)果相一致［12］，但本研究結(jié)果表明曲馬多與嗎啡誘導腫瘤細胞凋亡的機制并不完全相同，曲馬多僅增加caspase-3激活片段的表達，而對caspase-8激活片段的表達并無明顯影響。表明與嗎啡促進腫瘤細胞凋亡過程不同，曲馬多可能通過其他通路最終激活 caspase-3，中間并不通過caspase-8通路的激活。其具體通路尚有待研究。

總之，嗎啡和曲馬多均可濃度依賴性促進MADB-106乳腺癌細胞的凋亡、抑制腫瘤細胞的生長與增殖。嗎啡和曲馬多誘導MADB-106乳腺癌細胞的凋亡均與caspase-3途徑有關，嗎啡可能通過激活caspase-8從而激活caspase-3途徑，而曲馬多激活caspase-3途徑與caspase-8激活無關。

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