新型褪黑素受體激動劑Neu-P11激活A(yù)MPK減輕心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷

黃 靚，王漢群，張 弛，高勇強(qiáng)，向 瓊，王平平，尹衛(wèi)東

(南華大學(xué)1.心血管疾病研究所、2.外科學(xué)總論教研室，湖南衡陽 421001)

褪黑素(melatonin，MT)是一種主要由松果體分泌的吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素。研究發(fā)現(xiàn)［1］，褪黑素對心肌缺血/再灌注(ischemia/reperfusion，I/R)損傷具有明顯的保護(hù)作用，但由于褪黑素提取困難、半衰期短、大劑量使用副作用較大等特點(diǎn)，臨床應(yīng)用價(jià)值有限。因此，新型褪黑素受體激動劑將有可能成為減輕心肌I/R損傷的新藥物。Neu-P11是由本項(xiàng)目組與以色列Neurim Pharmaceuticals公司共同研制開發(fā)的一種高效、非選擇性的MT1/MT2受體激動劑，它半衰期長，能激活褪黑素受體，從而起到類似褪黑素的作用［2］。

腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是一種細(xì)胞內(nèi)能量感受器，當(dāng)細(xì)胞受到任何引起ATP生成減少與消耗增加的應(yīng)激刺激時(shí)，AMP/ATP比值增加，AMPK則被激活。多項(xiàng)研究表明［3－4］，通過激活A(yù)MPK信號途徑能夠減輕心肌I/R損傷。我們曾發(fā)現(xiàn)Neu-P11能夠激活脂肪細(xì)胞AMPK，改善3T3-L1脂肪細(xì)胞的胰島素抵抗［5］。據(jù)此，我們推測Neu-P11還可能通過影響心肌細(xì)胞AMPK信號通路，產(chǎn)生相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)利用大鼠H9c2心肌細(xì)胞系建立缺氧/復(fù)氧模型，模擬體內(nèi)心肌缺血/再灌注損傷，研究Neu-P11對心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧的作用及分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞株 H9c2心肌細(xì)胞株購自上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞庫。

1.2 主要試劑 Neu-P11由以色列Neurim Pharmaceuticals公司提供，AMPK抑制劑Compound C購自Sigma-Aldrich公司。乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)、肌酸激酶(creatine kinase，CK)檢測試劑盒購自南京建成生物工程研究所。超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測試劑盒、細(xì)胞裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自碧云天生物技術(shù)研究所。其它化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純產(chǎn)品。

1.3 缺氧/復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷模型的建立 ①將H9c2心肌細(xì)胞按2×106/瓶的細(xì)胞數(shù)接種，置含15% ～20%血清的DMEM培基中常規(guī)培養(yǎng)3～4 d;細(xì)胞處理前24 h換用無血清的DMEM液(Glucose 45 000 mg·L－1)培養(yǎng)，使細(xì)胞生長同步于G0期;②實(shí)驗(yàn)開始前0.5 h，制備模擬缺血缺氧液;將細(xì)胞換用模擬缺血缺氧液(Glucose 10 000 mg·L－1)，再將心肌細(xì)胞和厭氧指示劑一起置于雙層自封密閉袋的深處，充入低氧氣體(95%N2，5%CO2)，5 L·min－1，以驅(qū)逐瓶內(nèi)空氣，持續(xù)30 min，同時(shí)觀察厭氧指示劑，待厭氧指示劑由紫色變成粉紅色(提示瓶內(nèi)氧氣濃度低于0.1%)后，將雙層自封密閉袋封閉，維持自封袋內(nèi)無氧狀態(tài)2 h;③改供常氧，培養(yǎng)液換用含血清的DMEM(Glucose 45 000 mg·L－1)培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h。

1.4 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分組 實(shí)驗(yàn)分為5組:①常氧對照組:實(shí)驗(yàn)開始后不給予任何干預(yù)措施，僅以無血清的DMEM培養(yǎng)液與實(shí)驗(yàn)組同步培養(yǎng)，待實(shí)驗(yàn)完畢后與實(shí)驗(yàn)組同時(shí)收集標(biāo)本進(jìn)行檢測;②缺氧/復(fù)氧組(H/R組):經(jīng)歷2 h缺氧后改供常氧氣體24 h;③Neu-P11+H/R處理組:Neu-P11加入無血清的DMEM培養(yǎng)液中，濃度為 1 μmol·L－1，培養(yǎng) 12 h 后，換以新鮮的無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，后續(xù)處理同缺氧/復(fù)氧組。④Neu-P11+Compound C+H/R組:先用 10 μmol·L－1Compound C 處理細(xì)胞 30 min后，換新鮮無血清培養(yǎng)基，再加入1 μmol·L－1Neu-P11，培養(yǎng)12 h后，換以新鮮的無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，后續(xù)處理同缺氧/復(fù)氧組。⑤Compound C+H/R 組:先用 10 μmol·L－1Compound C處理細(xì)胞30 min后，換以新鮮的無血清DMEM培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)，后續(xù)處理同缺氧/復(fù)氧組。

1.5 流式細(xì)胞儀檢測心肌細(xì)胞凋亡 各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞按要求處理后，2.5 g·L－1胰蛋白酶消化貼壁的心肌細(xì)胞，1 000 r·min－1離心 10 min，去上清，PBS漂洗2次，沉淀中加入70%乙醇固定。1 000 r·min－1離心10 min，去上清，PBS漂洗2次，調(diào)整細(xì)胞濃度為1 ×109·L－1。加50 μl RNase至終濃度 1 g·L－1，37℃水浴 30 min。加 PI至終濃度 50 mg·L－1，350目尼龍網(wǎng)濾膜過濾去除細(xì)胞團(tuán)塊，4℃避光染色30 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(激發(fā)波長:488 nm;發(fā)射波長:610 nm)各期細(xì)胞DNA的含量。測定數(shù)據(jù)按流式細(xì)胞儀所配置的軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以DNA組方圖出現(xiàn)低于G1期DNA含量的亞G1峰的大小代表凋亡細(xì)胞的多少。

1.6 LDH、CK的測定 實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，取每組細(xì)胞培養(yǎng)液，嚴(yán)格按照試劑盒說明測定LDH和CK的含量。

1.7 SOD、MDA的測定 實(shí)驗(yàn)終止時(shí)，收集各組細(xì)胞，用4℃PBS洗滌3遍后，加入適量4℃細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，4℃離心后取上清液待測。檢測步驟按試劑盒說明書進(jìn)行。

1.8 AMPK活性的檢測 參照文獻(xiàn)報(bào)道的方法［6－7］，選用 MBL 公司 AMPK 活性檢測試劑盒(CY-1182)，操作步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行。

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞凋亡百分率的比較 結(jié)果如Tab 1所示，H/R組細(xì)胞凋亡百分率為(35.6±3.8)%，而H/R+Neu-P11組細(xì)胞凋亡百分率僅為(12.7±2.3)%，兩組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。另外，H/R+Neu-P11+Compound C組與H/R+Neu-P11組比較，細(xì)胞凋亡率明顯增加(P＜0.05)，說明加入AMPK的阻斷劑Compound C，能夠部分取消Neu-P11的抗細(xì)胞凋亡效應(yīng)。

Tab 1 Comparison of the rate of apoptosis of each group(±s，n=10)

Tab 1 Comparison of the rate of apoptosis of each group(±s，n=10)

*P＜0.05 vs control;#P＜0.05 vs H/R;+P＜0.05 vs H/R+Neu-P11

Group Apoptotic rate/%Control 4.3 ±1.2 H/R 35.6 ±3.8*H/R+Neu-P11 12.7 ±2.3#H/R+Neu-P11+Compound C 21.6 ±4.5+H/R+Compound C 48.6 ±4.2#

2.2 Neu-P11預(yù)處理對H9c2心肌細(xì)胞CK、LDH、MDA、SOD水平的影響 結(jié)果如Tab 2所示，H/R組細(xì)胞CK、LDH、MDA水平明顯上升，而SOD水平明顯下降，與Control組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。然而，H/R+Neu-P11組細(xì)胞較H/R組細(xì)胞CK、LDH、MDA水平明顯下降，SOD水平明顯升高，與H/R組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

Tab 2 Effect of Neu-P11 on CK，LDH，MDA and SOD of cultured H9C2 cardiomyocytes by A/R injury(±s，n=10)

Tab 2 Effect of Neu-P11 on CK，LDH，MDA and SOD of cultured H9C2 cardiomyocytes by A/R injury(±s，n=10)

*P ＜0.05 vs control;#P ＜0.05 vs H/R;+P ＜0.05 vs H/R+Neu-P11.

Group CK/U·L－1 LDH/U·L－1 MDA/μmol·g－1Pro SOD/U·mg－1Pro Control 1386±276 715±72 2.5±1.0 65±20 H/R 2549±443* 1216±176* 7.6±2.3* 42±17*H/R+Neu-P11 1724±335# 863±115# 4.0±1.6# 61±18#H/R+Neu-P11+Compound C 2239±542+1021±148+ 6.6±1.9+ 41±20+H/R+Compound C 2716±691# 1295±158# 8.5±2.8# 46±23#

2.3 Neu-P11預(yù)處理對H9C2心肌細(xì)胞AMPK活性的影響 結(jié)果如Fig 1所示。H/R組細(xì)胞AMPK活性明顯降低，與對照組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Neu-P11預(yù)處理可以明顯改善H/R組細(xì)胞AMPK的活性，H/R+Neu-P11組與H/R組比較，AMPK活性明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

3 討論

Fig 1 Effect Neu-P11 pretreatment on AMPK activity ofH9C2 myocardial cells

近年來許多研究表明，褪黑素不僅可以抑制自由基的產(chǎn)生，而且能直接消除已形成的自由基及其相關(guān)反應(yīng)物的活性，減輕心肌的缺血/再灌注損傷，預(yù)防短暫缺血/再灌注引起的心律失常，減少30 min缺血和2h再灌注引起的心肌梗死面積，可明顯改善缺血/再灌注后心肌血流動力學(xué)［8］。其作用機(jī)制主要包括以下幾個(gè)方面:直接清除自由基，防止其對組織細(xì)胞的損害;抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng);抑制炎性反應(yīng)，從而減少自由基的生成;穩(wěn)定細(xì)胞膜，增加細(xì)胞膜對氧化損傷的抵抗力，在高濃度自由基環(huán)境下褪黑素可上調(diào)Ca2+通道的數(shù)量及功能狀態(tài)，避免細(xì)胞內(nèi)鈣超載的發(fā)生;抑制線粒體通透性轉(zhuǎn)換孔的開放;減少白細(xì)胞黏附與聚集。

Neu-P11是一種新型褪黑素非選擇性受體激動劑，與褪黑素受體MT1/MT2具有高親和力，能發(fā)揮類似褪黑素的作用。本實(shí)驗(yàn)采用體外培養(yǎng)的H9C2細(xì)胞建立缺氧/復(fù)氧模型，模擬體內(nèi)的心肌缺血/再灌注損傷，從細(xì)胞水平對Neu-P11抗心肌缺血/再灌注損傷的保護(hù)作用及作用機(jī)制進(jìn)行研究。由于細(xì)胞膜通透性增高，使心肌富含有的酶，如LDH、CK等大量釋放進(jìn)入血液，因此血清中這些酶活性升高的程度，即可反映心肌損害的程度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Neu-P11可明顯減少H/R后培養(yǎng)基中CK及LDH水平，說明Neu-P11可減輕細(xì)胞膜的損傷程度，降低細(xì)胞膜通透性，具有心肌細(xì)胞膜的穩(wěn)定作用。缺血后再灌注，機(jī)體通過多種途徑產(chǎn)生多種自由基，造成細(xì)胞膜脂質(zhì)產(chǎn)生過氧化反應(yīng)。MDA是脂質(zhì)過氧化反應(yīng)的主要產(chǎn)物，因此測定心肌內(nèi)MDA含量，可反映脂質(zhì)過氧化程度;體內(nèi)自由基的清除依靠SOD等抗氧化酶系統(tǒng)，因此測定SOD活性可以間接反映機(jī)體清除氧自由基的能力。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，心肌細(xì)胞H/R后MDA含量明顯增加，SOD活性下降，而應(yīng)用Neu-P11預(yù)處理后，MDA含量明顯下降，SOD活性顯著增強(qiáng)，提示Neu-P11能夠減輕脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，保護(hù)線粒體結(jié)構(gòu)，減輕心肌缺血/再灌注損傷。細(xì)胞凋亡是缺血/再灌注組織損傷功能喪失的重要原因，心肌缺血/再灌注時(shí)，大量氧自由基產(chǎn)生，細(xì)胞內(nèi)鈣超載及線粒體損傷等均可促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，造成心肌損傷。本實(shí)驗(yàn)中我們用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率，結(jié)果顯示Neu-P11可明顯抑制心肌細(xì)胞凋亡，對H/R損傷心肌細(xì)胞凋亡有明顯保護(hù)作用。

AMPK作為一種能量調(diào)控器，對心臟尤其是當(dāng)心臟面臨缺血性損傷對能量需求明顯增加時(shí)具有重要作用［9］?；罨腁MPK能夠增加葡萄糖攝取和糖酵解，加速脂肪酸氧化增加心肌組織的能量供應(yīng)，并能抑制心肌細(xì)胞凋亡來保護(hù)心肌組織［10］。本研究還顯示，AMPK特異性抑制劑Compound C可部分阻斷Neu-P11在H/R中抗細(xì)胞凋亡的作用。H/R+Neu-P11+Compound C組細(xì)胞凋亡率等各項(xiàng)指標(biāo)較H/R+Neu-P11組明顯惡化，AMPK磷酸化水平降低，提示Neu-P11可能通過AMPK途徑在H/R中發(fā)揮其抗細(xì)胞凋亡的作用。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還顯示，與H/R組相比，H/R+Compound C組中各項(xiàng)指標(biāo)變化更為明顯，也證實(shí)了AMPK對H/R心肌細(xì)胞的抗凋亡作用。

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