骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向角膜上皮細(xì)胞分化及其免疫調(diào)節(jié)作用

Li Wen Meidong Zhu Con Petsoglou

角膜是位于眼前端的透明組織，由復(fù)層上皮，基質(zhì)層和單層內(nèi)皮組成。作為最前端的眼睛屈光介質(zhì)，角膜發(fā)揮著非常重要的作用。角膜上皮是一種可以快速增生的復(fù)層上皮，它在維持眼表角膜的透明性和完整性方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用。位于角膜緣基底部上皮中的角膜緣干細(xì)胞（limbal stem cells，LSCs)負(fù)責(zé)維持角膜上皮細(xì)胞的再生[1-2]。除了更新角膜上皮，LSCs也是介于結(jié)膜上皮與角膜上皮之間的屏障，防止前者向后者的移行[3]。

角膜緣干細(xì)胞缺乏癥（LSC deficiency，LSCD）是一種以LSCs功能缺失或數(shù)目減少為特征的疾病。這種疾病有多種誘因，包括化學(xué)或者熱灼傷，佩戴角膜接觸鏡誘導(dǎo)的眼表疾病，遺傳性（如無(wú)虹膜和外胚層發(fā)育不良癥），醫(yī)源性因素（如放射線療法和冷凍療法）和炎癥眼部疾?。ㄈ缍嘈涡约t斑和眼瘢痕性類(lèi)天皰瘡）[4]。在LSCD中，結(jié)膜上皮和其下的血管會(huì)生長(zhǎng)到角膜表面從而導(dǎo)致視覺(jué)障礙，甚至失明。此外，被破壞的角膜上皮將失去自愈能力，從而導(dǎo)致持續(xù)的上皮糜爛和缺失，患者會(huì)出現(xiàn)慢性疼痛和畏光的癥狀[4]。

角膜緣移植是治療LSCD的最有效方法[5]。該技術(shù)需要移植大片健康的角膜緣，其來(lái)源包括患者的另一只健康眼球（自體移植）或活體和死者捐獻(xiàn)的眼球（異體移植）。但每種手術(shù)都有很大的局限性。在自體移植和活體來(lái)源異體移植手術(shù)中，由于可能產(chǎn)生醫(yī)源性的LSCD風(fēng)險(xiǎn)導(dǎo)致可供移植的角膜緣組織量非常有限[3-4]。此外，無(wú)論從活體還是尸體捐獻(xiàn)的異體組織都存在組織量有限和免疫排斥的問(wèn)題。根據(jù)2012年的”澳大利亞角膜移植登記”報(bào)告，角膜緣移植1年的存活率為64﹪，5年的存活率只有43﹪[6]確鑿證據(jù)表明，異體角膜緣移植的存活需要持續(xù)的全身免疫抑制[7]，這種免疫抑制會(huì)導(dǎo)致患者其他疾病發(fā)病率升高及患者生活質(zhì)量顯著下降[8]，因此，迫切需要研發(fā)一種替代物用于移植以取代損傷角膜組織。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）被認(rèn)為是一種可以自我更新的多潛能前體細(xì)胞，能夠分化為多種間質(zhì)細(xì)胞。MSCs可從骨髓中分離獲得，并能在體內(nèi)外培養(yǎng)和分化。骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow-derived MSCs，BMMSCs）已被應(yīng)用于不同器官和組織的移植。由于它們?cè)诮M織再生方面的應(yīng)用潛能，受到越來(lái)越多的關(guān)注[9-11]。已有研究表明，不同物種的BMMSCs都可以分化為上皮樣細(xì)胞[12-15]。BMMSCs可以通過(guò)體內(nèi)血管注射移植到受損的角膜，這些細(xì)胞可以通過(guò)分化，增殖以及與造血干細(xì)胞協(xié)作從而促進(jìn)角膜傷口修復(fù)[14-15]。但是各實(shí)驗(yàn)室用于分離和分化BMMSCs的方法仍存在很大的差別。此外MSCs除具有轉(zhuǎn)分化作用，還具有抗炎和抗新生血管的作用[16-18]，研究證明MSCs移植治療的機(jī)制可能同時(shí)包含抗炎和抗新生血管的作用[15,19]。將損傷的角膜上皮細(xì)胞與MSC共培養(yǎng)時(shí)，MSCs分泌可溶性因子具有免疫抑制和抗新生血管的作用[18]。

至今，BMMSC通過(guò)免疫調(diào)節(jié)作用修復(fù)損傷角膜的機(jī)制尚未闡明。本研究分離培養(yǎng)大鼠BMMSCs（rBMMSCs），并通過(guò)角膜上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)微環(huán)境誘導(dǎo)其分化為上皮樣細(xì)胞。同時(shí)，聯(lián)合應(yīng)用IFN-γ和TNF-α模擬炎癥微環(huán)境作用于共培養(yǎng)的rBMMSCs和角膜上皮細(xì)胞(human corneal epithelial cells，hCECs)模式以闡述rBMMSCs對(duì)炎癥因子刺激的hCECs中ICAM-1的表達(dá)，以及對(duì)單核細(xì)胞黏附于hCECs能力的調(diào)控作用。

材料和方法

一、材料

1.試劑：胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS)、DMEM低糖培養(yǎng)基（DMEM/LG）、DMEM高糖培養(yǎng)基（DMEM/HG）、DMEM/F12培 養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基(RPMI-1640)、青霉素/鏈霉素、人表皮生長(zhǎng)因子（EGF）和trypsin/EDTA均購(gòu)于Gibco（Invitrogen，Australia，Pty Ltd.Sydney,Australia）組織培養(yǎng)的塑料皿購(gòu)于（Nunc，Australia，Pty Ltd.）Ficoll-PaqueTM PLUS(Sigma-Aldrich,St.Louis,USA)。

2.抗體：本研究使用的抗體為異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記的小鼠抗大鼠CD34、兔抗人和鼠ZO-1抗體 (Santa Cruz Biotechnology Inc.Sydney,NSW,Australia)、PE標(biāo)記的倉(cāng)鼠抗大鼠CD29、Alexa熒光素488標(biāo)記的鼠抗人CD54(ICAM-1)抗體(Biolegend，Balcatta,Western Australia)、PE標(biāo)記的倉(cāng)鼠IgG(Biolegend)、FITC標(biāo)記的小鼠IgG(Santa Cruz Biotechnology)、鼠抗角蛋白5&8抗體 (CK5&8)(Abcam，UK)、兔IgG(Amrad Biotech Pty.Ltd.，Melbourne，Australia)和鼠IgG(Zymed,Invitrogen)作為陰性對(duì)照，F(xiàn)ITC標(biāo)記的羊抗鼠二抗(Amrad Biotech Pty Ltd.,Australia)。Alexa熒光素594標(biāo)記的羊抗鼠和Alexa熒光素488標(biāo)記的羊抗兔等二抗(Molecular Probe,Australia)。所有用于流式細(xì)胞檢測(cè)和免疫熒光染色的抗體均經(jīng)過(guò)滴度測(cè)定。

二、方法

（一）組織培養(yǎng)

本研究經(jīng)悉尼大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。實(shí)驗(yàn)中所有操作都遵循悉尼大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)制定的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物操作規(guī)范。

1.MSC分離和培養(yǎng)：采用CO2處死3～6周齡的Vista大鼠。收集股骨和脛骨，去除骨骺暴露骨髓腔，采用10ml的注射器和添加了10﹪FBS及抗生素的DMEM/LG將骨髓內(nèi)容物從股骨和脛骨的骨髓腔中沖出。用16、18或20 G的針頭接在同一個(gè)10ml注射器上，通過(guò)不斷的吹打?qū)⒐撬璺稚⒊蓡蝹€(gè)細(xì)胞。將骨髓細(xì)胞小心轉(zhuǎn)移到50ml離心管中15ml的Ficoll-PaqueTM液面上，18℃，800×g離心20min。收集界面層的細(xì)胞，用新鮮的DMEM/LG洗2次，4℃，400×g離心10min。細(xì)胞重懸于含15﹪FBS，50 U/ml青霉素/50 μg/ml鏈霉素和2mmol/L谷氨酰胺的DMEM/LG中。將5×106細(xì)胞接種到25 cm2的培養(yǎng)瓶中，5﹪ CO2，37℃培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁2 d后進(jìn)行換液，之后每周換液2次。細(xì)胞融合后用0.25﹪胰酶/0.1﹪EDTA消化傳代，培養(yǎng)液改用含10﹪FBS。3-4代的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

2.rBMMSC條件培養(yǎng)液制備：在培養(yǎng)融合后第1代細(xì)胞的25 cm2培養(yǎng)瓶中加入5ml含5﹪FBS，50 U/ml青霉素/50 μg/ml鏈霉素和2mmol/L谷氨酰胺的DMEM/LG的新鮮培養(yǎng)液，2 d后收集培養(yǎng)液，離心并保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

3.大鼠皮膚成纖維細(xì)胞分離培養(yǎng)：從大鼠身上獲取皮膚組織，PBS洗2次，剪刀剪成碎塊。用瓷研缽和研杵勻漿組織，用0.25﹪胰酶/0.1﹪EDTA，37℃，持續(xù)震蕩消化20min。用含10﹪牛血清的培養(yǎng)液終止消化后，經(jīng)70目濾器過(guò)濾。細(xì)胞重懸在含10﹪FBS，50 U/ml青霉素/50 μg/ml鏈霉素和2mmol/L谷氨酰胺的DMEM/LG培養(yǎng)液中培養(yǎng)，每周換液2次。細(xì)胞融合后用0.25﹪胰酶/0.1﹪EDTA消化傳代，3-4代細(xì)胞作為陰性對(duì)照細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

4.永生化hCECs培養(yǎng)：實(shí)驗(yàn)用人SV40腺病毒載體轉(zhuǎn)化的hCECs培養(yǎng)于含5﹪FBS、50 U/ml青霉素/50 μg/ml鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺和10 ng/ml EGF的DMEM/F12培養(yǎng)液中。細(xì)胞長(zhǎng)滿(mǎn)融合后用0.25﹪胰酶/0.1﹪ EDTA消化傳代。

人白血病單核淋巴瘤細(xì)胞系U937細(xì)胞培養(yǎng)在含5﹪FBS、50 U/ml青霉素/50 μg/ml鏈霉素和2mmol/L谷氨酰胺的RPMI-1640培養(yǎng)液中。細(xì)胞按1:5比例，每周傳代2次。

（二）誘導(dǎo)rBMMSCs分化

第二代rBMMSCs和表皮成纖維細(xì)胞重懸于含5﹪FBS、50 U/ml青霉素/50 μg/ml鏈霉素和2mmol/L谷氨酰胺的DMEM/LG的培養(yǎng)液并接種于6孔板。培養(yǎng)過(guò)夜后，更換含5﹪FBS、50 U/ml青霉素/50 μg/ml鏈霉素、2mmol/L谷氨酰胺和10 ng/ml EGF的DMEM/F12培養(yǎng)液。分別于培養(yǎng)5 d和3周后，采用流式細(xì)胞技術(shù)，免疫組化和Westernblot鑒定分化的細(xì)胞。

（三）rBMMSCs對(duì)hCECs的免疫調(diào)節(jié)作用

hCECs和rBMMSCs共培養(yǎng)：hCECs接種于6孔板中，MSC細(xì)胞接種到Transwell插入膜上（孔徑 ：0.45 μm，直徑 24.5 mm，康寧公司，NY，USA），并置于6孔中培養(yǎng)的hCECs上面。

1.處理方案：處理方案共分為以下幾組：(1) 未處理 hCECs；(2)hCECs培養(yǎng) 3 d 后用 INF-γ(100 U/ml)和TNF-α(100 U/ml)處理 24及 48h；(3)hCECs在hCEC培養(yǎng)液和rBMMSC條件培養(yǎng)液（1:1）中培養(yǎng) 3 d，再用 INF-γ(100 U/ml) 和TNF-α (100 U/ml)處理24及48h。培養(yǎng)結(jié)束后，采用流式細(xì)胞技術(shù)分析細(xì)胞表型變化。

2.黏附實(shí)驗(yàn)：hCECs接種在24孔板中（8×103/孔），用hCEC培養(yǎng)基或含rBMMSC條件培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)3 d。含rBMMSC條件培養(yǎng)基的培養(yǎng)液為1:1hCEC培養(yǎng)基：rBMMSC條件培養(yǎng)基。3 d后分別更換新鮮培養(yǎng)液，并用INF-γ (100 U/ml) 和TNF-α(100 U/ml) 處理 6 h。采 用CM-Dil標(biāo) 記U937細(xì) 胞1h（Molecular probes，Invitrogen）。PBS洗 3次，將U937細(xì)胞分別加入各孔中（5×104/孔），37℃孵育 1h。采用細(xì)胞培養(yǎng)液洗3次，繼而PBS洗2次除去未結(jié)合的U937細(xì)胞。消化收集細(xì)胞并重懸于0.2ml培養(yǎng)基中。在倒置熒光顯微鏡計(jì)數(shù)U937細(xì)胞，3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)2次。

（四）流式細(xì)胞檢測(cè)

第3代rBMMSCs用胰酶消化收集。細(xì)胞用PE標(biāo)記的抗CD29，或FITC標(biāo)記的抗CD34，或同型對(duì)照抗體4℃孵育1h。PBS清洗細(xì)胞后用培養(yǎng)液重懸后用于流式細(xì)胞分析?；虿捎?﹪?yán)涠嗑奂兹┕潭?xì)胞15min，PBS洗2次，0.4﹪皂素重懸細(xì)胞，10min后離心，細(xì)胞用抗CD29和抗CK5&8抗體或同型對(duì)照抗體4℃孵育1h。PBS清洗細(xì)胞2次，用FITC標(biāo)記的抗小鼠抗體4℃孵育1h。PBS清洗細(xì)胞后，重懸后用于流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson,Sydney,Australia)分析。每個(gè)樣品分析位于同一區(qū)域的104個(gè)細(xì)胞。用CELLQUEST程序（Becton Dickinson）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以直方圖、散點(diǎn)圖或條形圖表示。

（五）免疫熒光

將rBMMSCs接種到48孔培養(yǎng)板中（5×103/孔），培養(yǎng)細(xì)胞用2﹪多聚甲醛4℃固定，PBS清洗10min，并在10﹪驢血清/0.4﹪皂苷/PBS中封閉15min，然后用抗CD29，抗CD34抗體，抗CK5&8和抗ZO-1抗體4℃孵育過(guò)夜。小鼠或兔IgG作為陰性對(duì)照。PBS清洗3次，細(xì)胞同熒光素488標(biāo)記的羊抗兔或熒光素594標(biāo)記的山羊抗小鼠二抗室溫孵育1h。用Hoechest33342（Sigma）共染細(xì)胞，倒置熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察。

（六）Western blot 檢測(cè)CK5&8的表達(dá)

rBMMSCs、hCECs和大鼠皮膚成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)融合后，經(jīng)預(yù)冷的PBS清洗2次，加入含有蛋白酶抑制劑的預(yù)冷裂解液裂解，采用Bradford法進(jìn)行蛋白定量。樣品上樣（15 μg/孔），進(jìn)行10﹪的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF(Invitrogen)膜上，用封閉液(Santa Cruz)室溫封閉30min，抗CK5&8的抗體4℃孵育過(guò)夜，洗膜后，同HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗(Millipore,MA USA)室溫孵育2h，用化學(xué)發(fā)光法進(jìn)行信號(hào)檢測(cè)。膜結(jié)合的抗體用洗脫液(Thermo Scientific)除去后與鼠源抗GAPDH抗體(Hytest Ltd.Finland)孵育作為內(nèi)參。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 5(GraphPad Software,La Jolla,CA,USA)軟件分析，各組數(shù)據(jù)均采用表示，多組間比較采用帶有Tukey’s多重比較的單因素方差分析（ANOVA），兩組間比較采用雙側(cè)t檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、大鼠rBMMSCs的形態(tài)和免疫表型

本研究首先建立了從大鼠骨髓中分離rBMMSCs的方法。rBMMSCs分離培養(yǎng)72h后進(jìn)行首次換液，大多數(shù)不貼壁的細(xì)胞通過(guò)換液去除，接種培養(yǎng)5 d后，可見(jiàn)許多貼壁的成纖維樣的細(xì)胞(圖1a)。這些細(xì)胞呈現(xiàn)紡錘形，14 d后達(dá)到融合生長(zhǎng)(圖1b)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示這些細(xì)胞呈CD29陽(yáng)性表達(dá)，陽(yáng)性率達(dá)95﹪(圖2a)，CD34呈陰性表達(dá)(圖2b)。免疫熒光染色進(jìn)一步確定rBMMSCs陽(yáng)性表達(dá)CD29，陰性表達(dá)CD34(圖 2c、d)。

二、鼠rBMMSCs向上皮樣細(xì)胞分化

本研究采用角膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基誘導(dǎo)rBMMSCs分化，培養(yǎng)5 d后，出現(xiàn)一些上皮細(xì)胞樣的小島，這些小島呈現(xiàn)典型的鵝卵石樣(圖3a)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，這些類(lèi)似于上皮細(xì)胞樣的小島中大約有4﹪的細(xì)胞表達(dá)上皮細(xì)胞的表面標(biāo)記抗原CK5&8(圖3b、c)，CK5&8陽(yáng)性細(xì)胞不表達(dá)CD29，證明rBMMSCs往上皮樣細(xì)胞分化過(guò)程中，細(xì)胞的免疫表型發(fā)生了改變。然而在相同的培養(yǎng)條件下，大鼠皮膚成纖維細(xì)胞中并未檢測(cè)到CK5&8陽(yáng)性表達(dá)的細(xì)胞(圖3d、e)。

圖1 倒置位相光學(xué)顯微鏡下觀察rBMMSCs的分離培養(yǎng)

圖2 流式細(xì)胞和免疫熒光分析rBMMSCs的表型

培養(yǎng)3周后，上皮樣的小島長(zhǎng)大，并且融合在一起形成大面積的具有鵝卵石樣的單層細(xì)胞結(jié)構(gòu)(圖4a、b)。雙色免疫熒光染色顯示分化的rBMMSCs中，細(xì)胞膜上高度表達(dá)ZO-1的細(xì)胞同時(shí)胞質(zhì)中也高度表達(dá)CK5&8 (圖4c、d、e)。而培養(yǎng)皿中形態(tài)上仍然保持紡錘樣的細(xì)胞，CK5&8和ZO-1都呈陰性表達(dá)(圖4c)。

Western blot進(jìn)一步確定rBMMSCs分化來(lái)的上皮樣細(xì)胞中CK5&8的表達(dá)。定量分析結(jié)果顯示，分化的rBMMSCs同hCECs相比，CK5&8蛋白表達(dá)沒(méi)有顯著性的差異(其值分別為191.6﹪±16.8﹪，226.7﹪±37.6﹪，P=0.443)，然而在相同分化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)的大鼠皮膚成纖維細(xì)胞幾乎檢測(cè)不到CK5&8的表達(dá)（6.3﹪±2.0﹪），明顯低于CK5&8在hCECs(226.7﹪±37.6﹪，P=0.0043)和分化的rBMMSCs中的表達(dá)(P < 0.01)(圖5)。

圖3 rBMMSCs體外分化5 d 情況

圖4 rBMMSCs體外分化3周

圖5 Western blot 檢測(cè)CK5&8的表達(dá)結(jié)果

三、rBMMSCs對(duì)細(xì)胞因子刺激的hCECs的調(diào)節(jié)作用

流式細(xì)胞分析結(jié)果顯示：hCECs恒定性的表 達(dá) ICAM-1。IFN-γ(100 U/ml) 和TNF-α(100 U/ml)刺激24 h后，ICAM-1的表達(dá)升高到達(dá)最大值，同未處理對(duì)照組相比，升高了10倍達(dá)到4524±554.2（P=0.0025）。處 理 48h 后 有 所下降，和未處理對(duì)照組相比，升高了8倍達(dá)到3107±329.6（P=0.0014)。然 而，rBMMSC 條件培養(yǎng)液能夠在24 h和48h顯著降低ICAM-1的上調(diào)表達(dá) [P=0.0249 (24h)，0.0184 (48h)]，且當(dāng)hCECs和rBMMSCs共培養(yǎng)時(shí)，rBMMSCs對(duì)ICAM-1表達(dá)的抑制更顯著，均值為1356±326（24 h），1323±107(48h) [P=0.0079 (24 h)，0.0024（48h）](圖 6)。

圖6 rBMMSCs對(duì)ICAM-1表達(dá)的調(diào)節(jié)作用

黏附結(jié)果顯示，和未處理對(duì)照組相比，IFN-γ和TNF-α共同刺激能夠顯著的增強(qiáng)U937單核細(xì)胞對(duì)hCEC的黏附力，然而，當(dāng)hCECs在rBMMSC條件培養(yǎng)液中培養(yǎng)3d后，被炎癥因子刺激后升高的U937單核細(xì)胞的黏附能力被完全終止,黏附細(xì)胞數(shù)從IFN-γ和TNF-α刺激后的 (10.01±3.01)×103/ml細(xì)胞降至 (2.21±0.19)×103/ml 細(xì)胞 (P=0.0271,圖 7)。

討 論

由于BMMSCs在分化潛能方面顯示出非常強(qiáng)的可塑性，所以它是一種非常適合用于治療的細(xì)胞資源。BMMSCs和其他器官來(lái)源的干細(xì)胞相比具有很多優(yōu)點(diǎn)：好鑒定，易分離，并且注射后經(jīng)血液可到達(dá)全身其他組織，相比之下更適合于細(xì)胞治療[20-21]。

圖7 rBMMSCs 對(duì) hCECs 黏附 U937 細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用

已經(jīng)有報(bào)道表明BMMSCs在經(jīng)過(guò)體內(nèi)注射或體外培養(yǎng)后能夠分化成各種類(lèi)型的上皮細(xì)胞。據(jù)報(bào)道，BMMSCs能夠分化為II型肺泡上皮細(xì)胞[22]、皮膚上皮細(xì)胞、皮脂腺導(dǎo)管細(xì)胞[23]、視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞[24]、角膜細(xì)胞[25]和角膜上皮樣細(xì)胞[13,26]。本研究成功分離培養(yǎng)了rBMMSCs，細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)CD29，陽(yáng)性率為95﹪，該結(jié)果和Gu從兔子中分離得到的BMMSCs非常相似，其得到的細(xì)胞CD29的陽(yáng)性率為97.5﹪，但是比Jiang從大鼠中分離得到的BMMSCs的CD29陽(yáng)性率（81.56﹪）更高。

干細(xì)胞的命運(yùn)受內(nèi)源性和外源性信號(hào)的調(diào)節(jié)，外源性信號(hào)組成干細(xì)胞調(diào)控的微環(huán)境，主要包括：分泌的因子，介導(dǎo)細(xì)胞間相互作的膜整合蛋白，細(xì)胞外基質(zhì)[27]。誘導(dǎo)MSCs分化成角膜上皮樣細(xì)胞的方法有很多種，這些方法通常是采用不同的角膜上皮相鄰細(xì)胞培養(yǎng)的上清液作為條件培養(yǎng)基[27-28]，或是通過(guò)與其他細(xì)胞共培養(yǎng)這兩種方式來(lái)提供外源調(diào)控信號(hào)[13]。和以往研究不同的是，本研究使用了一種簡(jiǎn)單的角膜上皮細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)液，這種培養(yǎng)液血清含量較低，不涉及到角膜上皮相鄰細(xì)胞，而且同樣可以用于誘導(dǎo)MSCs往上皮樣細(xì)胞分化。培養(yǎng)5 d后得到了CK5&8陽(yáng)性的細(xì)胞，而且分化效率達(dá)到4﹪，分化效率與其他研究結(jié)果相似[13，26]。大鼠成纖維細(xì)胞以同樣方法分化培養(yǎng)后，未檢測(cè)到CK5&8陽(yáng)性細(xì)胞。表明同樣的培養(yǎng)條件下表皮成纖維細(xì)胞不能被誘導(dǎo)分化為上皮樣細(xì)胞。本研究所用的培養(yǎng)條件因避免了rBMMSCs與角膜細(xì)胞產(chǎn)生接觸性的相互作用，因而推斷由角膜上皮細(xì)胞或rBMMSCs本身分泌的細(xì)胞因子作用于rBMMSCs，可能主要激活rBMMSCs內(nèi)源性信號(hào)通路，從而調(diào)節(jié)rBMMSCs分化，表明內(nèi)源性的調(diào)節(jié)信號(hào)也很重要。

BMMSCs的治療作用主要是通過(guò)細(xì)胞分化、免疫調(diào)節(jié)以及產(chǎn)生營(yíng)養(yǎng)和生長(zhǎng)因子作用于組織中的細(xì)胞。這些特點(diǎn)使其具備治療眼表病變和重塑眼睛角膜的潛能[29-30]。干細(xì)胞不僅可通過(guò)轉(zhuǎn)分化在角膜創(chuàng)傷愈合和上皮再生過(guò)程中發(fā)揮重要的作用[13-14，26]，其潛在的抗炎作用也逐漸受到更多的關(guān)注[15-19，31-32]。細(xì)胞黏附對(duì)細(xì)胞遷移是至關(guān)重要的，組織損傷的初始步驟是炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)到損傷部位，該過(guò)程依賴(lài)于黏附分子之間的相互作用，例如上皮細(xì)胞表面的ICAM-1[33]。ICAM-1屬于定位在淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞表面的免疫球蛋白超家族成員[3]，是β2-整合素(CD11/18)和Mac-1的配體。Mac-1在骨髓細(xì)胞和單核細(xì)胞中表達(dá)，促進(jìn)中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞黏附到表達(dá)ICAM-1的細(xì)胞表面，并促進(jìn)其在細(xì)胞表面的伸展[34-35]。IFN-γ/TNF-α 可 刺 激 hCECs 明 顯 提 高 表 達(dá)ICAM-1，并顯著增加單核細(xì)胞黏附到hCECs單層細(xì)胞上。然而同rBMMSCs共培養(yǎng)或使用rBMMSCs條件培養(yǎng)基可阻斷這一效應(yīng)。該結(jié)果同以往研究MSCs同肺內(nèi)皮細(xì)胞[36]或人臍帶內(nèi)皮細(xì)胞[37]共培養(yǎng)時(shí)也可抑制ICAM-1表達(dá)相一致。本研究首次證實(shí)BMMSCs抑制ICAM-1在角膜上皮上的表達(dá)。雖然BMMSCs對(duì)白細(xì)胞及上皮細(xì)胞表面ICAM-1表達(dá)的調(diào)控作用機(jī)制仍不十分清楚，但MSCs有可能同時(shí)調(diào)節(jié)損傷部位白細(xì)胞之間以及白細(xì)胞對(duì)組織細(xì)胞如上皮細(xì)胞的黏附作用[38]。

單核細(xì)胞是巨噬細(xì)胞和樹(shù)突狀細(xì)胞的前體，受微環(huán)境以及分化刺激信號(hào)調(diào)節(jié)，這幾種細(xì)胞表型可以相互轉(zhuǎn)換。在體內(nèi)，單核細(xì)胞可轉(zhuǎn)變成抗原提呈細(xì)胞或清道夫巨噬細(xì)胞。MSCs除可影響細(xì)胞黏附外，還可以體外抑制異源性細(xì)胞引起的T細(xì)胞增殖，從而介導(dǎo)系統(tǒng)性免疫抑制作用[39]。本研究結(jié)果顯示BMMSCs能夠抑制IFN-γ/TNF-α刺激后單核細(xì)胞對(duì)hCEC的黏附作用，從而進(jìn)一步證實(shí)BMMSCs的免疫抑制作用。

本研究探討異種rBMMSCs對(duì)hCECs的免疫調(diào)節(jié)作用。結(jié)果證實(shí)rBMMSCs能影響不同物種的靶細(xì)胞的抗炎作用。活體研究異種MSCs對(duì)角膜損傷的修復(fù)功能也支持這一觀點(diǎn)[15]。然而，以往的研究是把人BMMSC用于動(dòng)物模型，筆者是將大鼠BMMSC作用于人角膜上皮細(xì)胞。

BMMSCs通過(guò)調(diào)節(jié)炎癥因子修復(fù)損傷角膜的保護(hù)機(jī)制尚不清楚。同終末分化的細(xì)胞相比，MSCs突出的優(yōu)勢(shì)是它們的可塑性，以及在不同刺激下可以產(chǎn)生合適的微環(huán)境以利于細(xì)胞分化生長(zhǎng)。實(shí)際上，免疫系統(tǒng)的發(fā)育同間充質(zhì)組織密切相關(guān)，相互之間可在多個(gè)水平上發(fā)生相互作用。不可否認(rèn)，上皮樣細(xì)胞和免疫細(xì)胞的分化均需要一個(gè)特殊的微環(huán)境[40]。正如Anderson所講述[41]，細(xì)胞正常的功能同它們?cè)谂囵B(yǎng)條件下或移植到新的環(huán)境中所發(fā)揮的功能有很大的差異。然而，從細(xì)胞治療的角度出發(fā)，細(xì)胞能發(fā)揮的功能可能更重要。在大多數(shù)報(bào)道中，供體細(xì)胞發(fā)生分化，其分化表型可通過(guò)形態(tài)或免疫染色確定，但往往不能從功能上進(jìn)行驗(yàn)證。因此，供體細(xì)胞可能只獲得了新細(xì)胞類(lèi)型的很少的一部分特征，但是不具備新的功能。因而，有必要對(duì)分化細(xì)胞的功能進(jìn)一步驗(yàn)證。

本研究可獲得原代培養(yǎng)的純度較高的rBMMSCs。這些細(xì)胞有分化為角膜上皮樣細(xì)胞的潛能。促炎細(xì)胞因子可誘導(dǎo)hCECs細(xì)胞表達(dá)黏附分子，rBMMSCs可抑制這一誘導(dǎo)作用，并可阻斷促炎性因子誘導(dǎo)的單核細(xì)胞對(duì)hCEC黏附的作用。本研究開(kāi)啟了角膜組織工程利用MSCs治療角膜疾病比如LSCD的可能性。BMMSCs的免疫調(diào)節(jié)作用可能為角膜上皮再生提供更有利的微環(huán)境，表明BMMSCs在角膜損傷修復(fù)和再生過(guò)程中的治療潛能。

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