姜黃素對(duì)紫外線誘導(dǎo)損傷的HaCaT細(xì)胞的保護(hù)作用

鄧蕙妍，高愛莉，張倩雯，萬苗堅(jiān)，朱慧蘭

（1.廣東省廣州市皮膚病防治所，廣州510095；2.中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院，廣州510630）

短時(shí)間內(nèi)高強(qiáng)度紫外線（Ultraviolet，UV）照射人及動(dòng)物皮膚后會(huì)引起紅斑、水腫、大皰、脫屑、色素沉著等一系列急性光損傷的表現(xiàn)。紫外線引起皮膚急性光損傷的機(jī)制復(fù)雜，至今未完全闡明，既往研究顯示，在人皮膚急性光損傷的發(fā)病機(jī)制中，UVA、UVB引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)占有重要地位，是造成皮膚紅斑、水腫等急性炎癥反應(yīng)的重要原因。在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，活性氧（Reactive oxygen species，ROS）充當(dāng)了非常重要的角色。近年來的研究明確了ROS可影響皮膚結(jié)構(gòu)的完整性，并對(duì)下游分子的調(diào)控有肯定的作用，其中包括信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)和最終致癌性的啟動(dòng)等[1]。由此可見，降低ROS水平是減少UV對(duì)皮膚氧化損傷的重要一環(huán)。

姜黃素是傳統(tǒng)草藥姜黃的主要成分，多項(xiàng)研究提示姜黃素是強(qiáng)大的抗氧化劑，在多種細(xì)胞中被證實(shí)可清除胞內(nèi)ROS，有抗氧化作用[2-5]。但到目前為止，有關(guān)姜黃素對(duì)皮膚的抗氧化作用及其機(jī)制探討的相關(guān)報(bào)道不多。為探討姜黃素是否具有拮抗皮膚急性光損傷的作用，其對(duì)不同波長(zhǎng)紫外線造成皮膚損傷的保護(hù)作用如何，本實(shí)驗(yàn)比較了姜黃素干預(yù)前后，經(jīng)過UVA、UVB輻射的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞（HaCaT細(xì)胞）損傷程度變化及胞內(nèi)ROS水平的改變。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 樣品 永生化人表皮角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT細(xì)胞，購自廣州吉妮歐生物科技有限公司

1.1.2 主要試劑和儀器 姜黃素購自美國SIGMA公司，AnnexinV-FITC+PI凋亡檢測(cè)試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展公司，單溶液細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購自美國Promega公司，CM-H2DCFDA熒光探針購自美國Invitrogen公司。UVB燈管，波長(zhǎng)范圍290～320 nm，峰值 297 nm，40 W，UVA 燈管,波長(zhǎng)范圍320～400 nm，峰值365 nm，40 W，均購自北京電光源研究所，酶標(biāo)儀購自美國Diatek公司。

1.2 方法

1.2.1 UVA、UVB最佳劑量的確定和HaCaT細(xì)胞急性光損傷模型的建立，參考本課題組的前期研究結(jié)果[6]，在本實(shí)驗(yàn)中使用 UVA劑量為20 J/cm2，UVB劑量為57 mJ/cm2。

1.2.2 篩選無毒性的姜黃素濃度

1.2.2.1 HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為正常細(xì)胞對(duì)照組、細(xì)胞+1 μmol/L姜黃素組、細(xì)胞+2.5 μmol/L姜黃素組、細(xì)胞+5 μmol/L姜黃素組、細(xì)胞+10 μmol/L姜黃素組、細(xì)胞+20 μmol/L姜黃素組。分組加好藥物后37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.2.2 MTT法檢測(cè)姜黃素對(duì)細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響細(xì)胞分組處理后，每孔加MTT溶液（5 mg/mL用PBS配制，pH=7.4）20 μL繼續(xù)孵育4 h后終止培養(yǎng)，小心吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液，每孔加 150 μL的DMSO，振蕩10 min。選擇490 nm波長(zhǎng)，在酶聯(lián)免疫監(jiān)測(cè)儀上測(cè)定各孔吸光值，記錄結(jié)果，以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。

1.2.2.3 Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)姜黃素對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 細(xì)胞分組處理后，吸出培養(yǎng)液，適度消化，800 r/min離心15 min，去上清。預(yù)冷PBS洗2次，800 r/min離心15 min，收集細(xì)胞沉淀；打入70%（預(yù)冷）乙醇，4℃固定過夜；取出復(fù)溫，800 r/min離心 15 min，去乙醇，預(yù)冷 PBS洗 2次，800 r/min離心15 min，加0.5 mL Binding Buffer懸浮細(xì)胞，在懸浮細(xì)胞液中加入 5 μL AnnexinVFITC，2～8℃避光孵育15 min。加入10 μL碘化丙啶（PI）后于2～8℃避光孵育10 min，300目（孔徑40～50 μm）尼龍網(wǎng)過濾，上機(jī)檢測(cè)。

1.2.3 MTT法檢測(cè)添加姜黃素前后，UVA、UVB照射對(duì)細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響 方法同1.2.2.2。

1.2.4 Annexin V-PI雙染流式細(xì)胞儀檢測(cè)添加姜黃素前后，UVA、UVB照射對(duì)細(xì)胞凋亡率的影響 方法同1.2.2.3。

1.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化

1.2.5.1 HaCaT細(xì)胞隨機(jī)分為正常細(xì)胞對(duì)照組、細(xì)胞+UVA照射組、細(xì)胞+UVB照射組、細(xì)胞+各無毒性濃度姜黃素組、細(xì)胞+各無毒性濃度姜黃素+UVA照射組、細(xì)胞+各無毒性濃度姜黃素+UVB照射組

1.2.5.2 各組HaCaT細(xì)胞加入不同濃度的姜黃素處理及光照后換回新鮮的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18h，對(duì)照組不進(jìn)行照射直接換成完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)18 h。棄去培養(yǎng)基，用磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗1次，用胰酶消化成單細(xì)胞懸液，加入終濃度為5 μmol/L的 CM-H2DCFDA染液，37℃孵育15 min，離心，PBS漂洗1次后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6 各組數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)2組數(shù)據(jù)進(jìn)行配對(duì)t檢驗(yàn)。顯著性檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 篩選無毒性的姜黃素濃度 當(dāng)姜黃素濃度為1 μmol/L 和 2.5 μmol/L 時(shí)，HaCaT 細(xì)胞增殖沒有差異，濃度為5 μmol/L時(shí)，增殖受抑制，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），濃度為 10 μmol/L 和 20 μmol/L 時(shí)差異更明顯（P<0.05）。結(jié)果說明細(xì)胞增殖受姜黃素濃度影響，且隨濃度增加而降低，見圖1。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果提示，姜黃素濃度在20 μmol/L時(shí)，檢測(cè)到細(xì)胞凋亡有小幅上調(diào)，其余濃度沒有明顯變化，見圖2。結(jié)合細(xì)胞增殖和凋亡的檢測(cè)結(jié)果，我們認(rèn)為姜黃素濃度在5 μmol/L以下時(shí)，姜黃素對(duì)HaCaT細(xì)胞沒有損傷。由此，我們確定下步實(shí)驗(yàn)所需姜黃素濃度梯度為 1，2.5，5 μmol/L。

2.2 添加姜黃素前后，UVA、UVB照射引起HaCaT細(xì)胞損傷變化 無UVA照射時(shí)，添加不同濃度姜黃素，HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡情況與空白對(duì)照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；有UVA照射時(shí)，不添加姜黃素，細(xì)胞增殖明顯抑制（下降25%）、凋亡增加（增加13.5%）（P<0.05）；添加不同濃度姜黃素，細(xì)胞增殖抑制幅度降低，凋亡細(xì)胞減少（P<0.05），呈濃度依賴性，見圖3、圖4。同樣，無UVB照射時(shí)，添加不同濃度姜黃素，HaCaT細(xì)胞增殖和凋亡情況與空白對(duì)照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；有UVB照射時(shí)，不添加姜黃素，細(xì)胞增殖明顯抑制（下降25%）、凋亡增加（增加 11.9%）（P<0.05）；添加不同濃度姜黃素，細(xì)胞增殖抑制幅度降低，凋亡細(xì)胞減少（P<0.05），呈濃度依賴性，見圖5、圖6。

2.3 HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平變化 從流式結(jié)果可見，在沒有UVA照射情況下，細(xì)胞內(nèi)ROS水平較低，且各姜黃素濃度間差異不大；有UVA照射時(shí)，ROS水平大幅上升，與正常細(xì)胞相比，ROS增高67.9%。但隨姜黃素濃度升高，升幅減少，呈濃度依賴性，姜黃素濃度達(dá)到5 μmol/L時(shí)，ROS水平僅升高13.3%，與UVA照射組相比下降54.6%，見圖7。同樣，在沒有UVB照射情況下，細(xì)胞內(nèi)ROS水平較低，且各姜黃素濃度間差異不大；有UVB照射時(shí)，ROS水平大幅上升，與正常細(xì)胞相比ROS增高67.2%。但隨姜黃素濃度升高，升幅減少，呈濃度依賴性，姜黃素達(dá)到 5 μmol/L時(shí)，ROS水平僅升高14.3%，與單獨(dú)UVB照射組相比下降52.9%，見圖8。

3 討論

由于臭氧層的破壞和人們生活習(xí)慣的改變，急性光損傷的發(fā)生率越來越高，如何減輕急性光損傷的危害日益受到關(guān)注。因此，研究急性光損傷的發(fā)病機(jī)制及防治藥物具有重大的醫(yī)學(xué)和社會(huì)經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為，UVB可穿透皮膚幾毫米，主要由表皮吸收而引起皮膚紅斑，其照射是對(duì)皮膚產(chǎn)生光化學(xué)反應(yīng)中最活躍的部分，是導(dǎo)致皮膚曬傷的根源，造成皮膚損傷的主要原因，而UVA穿透真皮，引起紅斑的可能性是UVB的千分之一，一般不引起皮膚損傷[7]。但最近研究表明，雖然UVA和UVB因波長(zhǎng)不同，被皮膚吸收多少不一，實(shí)際上均會(huì)對(duì)皮膚造成急、慢性損傷，甚至導(dǎo)致各種皮膚腫瘤的發(fā)生[8]。由上述可知，為避免表皮細(xì)胞日曬傷，UVA和UVB的預(yù)防同樣重要，尋找對(duì)兩種不同波長(zhǎng)紫外線照射都有防護(hù)作用的防治藥物有重要意義。

目前對(duì)紫外線的防護(hù)分為物理防護(hù)和化學(xué)防護(hù)，不同原理的紫外線防護(hù)劑各有優(yōu)勢(shì)。近年的研究表明紫外線急性照射可以引起表皮細(xì)胞DNA損傷、氧化應(yīng)激和免疫抑制，其中，氧化應(yīng)激是造成皮膚紅斑、水腫等急性炎癥反應(yīng)的重要原因。在氧化應(yīng)激反應(yīng)中，ROS充當(dāng)了非常重要的角色。為了減少ROS對(duì)機(jī)體的損傷，國內(nèi)外學(xué)者設(shè)想用抗氧化藥物抑制ROS的生物毒性。在眾多抗氧化劑中，傳統(tǒng)草藥姜黃根莖中的姜黃素被廣泛關(guān)注。姜黃素的抗氧化作用強(qiáng)大，是維生素E的10倍以上[9]，且價(jià)格低廉，水溶性和脂溶性均好，低毒高效，另外其提取工藝成熟、不復(fù)雜，是理想的天然抗氧化劑。在本實(shí)驗(yàn)中，姜黃素濃度達(dá)到20 μmol/L時(shí)，HaCaT細(xì)胞才出現(xiàn)明顯的凋亡和壞死；但其濃度在5 μmol/L時(shí)細(xì)胞的增殖就受到抑制，活力下降。實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，姜黃素濃度大于5 μmol/L時(shí)，姜黃素對(duì)HaCaT細(xì)胞的生長(zhǎng)開始有影響，但由于濃度不足以對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生致命傷害，所以檢測(cè)不到凋亡和壞死的增高，當(dāng)濃度超過20 μmol/L時(shí)，高濃度的姜黃素對(duì)HaCaT細(xì)胞的傷害顯著，所以檢測(cè)到細(xì)胞凋亡和壞死的明顯增加。為了使姜黃素發(fā)揮作用的同時(shí)不對(duì)細(xì)胞本身的生長(zhǎng)產(chǎn)生影響，我們確定了1，2.5，5 μmol/L等濃度作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的姜黃素濃度梯度。

曾有國內(nèi)研究進(jìn)行了姜黃素對(duì)UVB誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞內(nèi)ROS水平影響的實(shí)驗(yàn)，證實(shí)了姜黃素對(duì)UVB的急性氧化損傷有抑制作用[10]，但在現(xiàn)實(shí)生活中，除了UVB以外，表皮細(xì)胞還會(huì)受到UVA照射損傷。此外，除了胞內(nèi)的ROS水平改變，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)是否也恢復(fù)呢？因此，為探討姜黃素是否對(duì)兩種波長(zhǎng)的紫外線照射都有防護(hù)作用，其作用強(qiáng)度是否一致，本實(shí)驗(yàn)通過細(xì)胞增殖和凋亡等生長(zhǎng)狀態(tài)和胞內(nèi)ROS水平，比較姜黃素對(duì)UVA、UVB兩種紫外線照射的防護(hù)作用。我們對(duì)HaCaT細(xì)胞進(jìn)行姜黃素預(yù)處理后，分別進(jìn)行了最佳劑量的UVA、UVB照射。結(jié)果顯示與添加姜黃素前相比，HaCaT細(xì)胞的增殖抑制幅度降低，凋亡細(xì)胞減少，細(xì)胞的損傷程度下降，細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)改善與姜黃素濃度呈正相關(guān)。胞內(nèi)的ROS水平與單純UV照射組比較明顯降低，而且隨著姜黃素濃度的增高，ROS水平下降越明顯，姜黃素達(dá)到5 μmol/L時(shí)，與單純UVA照射的HaCaT細(xì)胞相比，添加姜黃素后再照射的細(xì)胞內(nèi)ROS水平升幅降低54.4%，而UVB照射組中，ROS水平升幅降低52.9%。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明姜黃素對(duì)紫外線照射的HaCaT細(xì)胞具有抗氧化保護(hù)作用，并且呈濃度依耐性，比較添加姜黃素前后，UVA、UVB照射引起的ROS水平變化，可以看出姜黃素對(duì)UVA、UVB兩種波長(zhǎng)誘導(dǎo)的HaCaT細(xì)胞光損傷具有相同的保護(hù)作用，但其通過何種機(jī)制發(fā)揮作用尚需要進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)深入探討。

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