白癜風(fēng)自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植療效與白細(xì)胞介素17、Foxp3的相關(guān)性研究

李曉文 林福全 張迪敏 洪為松 許愛(ài)娥

白癜風(fēng)自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植療效與白細(xì)胞介素17、Foxp3的相關(guān)性研究

李曉文 林福全 張迪敏 洪為松 許愛(ài)娥

目的探討白癜風(fēng)自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植療效與白細(xì)胞介素17、Foxp3的相關(guān)性。方法對(duì)40例穩(wěn)定期尋常型白癜風(fēng)患者進(jìn)行自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植,同時(shí)收集其外周血,6個(gè)月后根據(jù)移植效果將收集的血液分為成功組25例,失敗組15例。用ELISA的方法測(cè)定移植成功與移植失敗外周血中白細(xì)胞介素17及Foxp3水平,比較移植成功組與失敗組血清中白細(xì)胞介素17及Foxp3水平的差異。用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果移植成功組血清中白細(xì)胞介素17(15.29±7.86)ng/L,明顯低于移植失敗組(43.88± 13.02)ng/L,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。血清中Foxp3的水平,移植成功組(6.08±2.03)ng/L,高于移植失敗組(3.37± 1.81)ng/L,兩者之間比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)論血清白細(xì)胞介素17水平升高、Foxp3水平降低與白癜風(fēng)患者的移植失敗有相關(guān)性。

白癜風(fēng);白細(xì)胞介素17;Foxp3;細(xì)胞移植;移植,自體;治療結(jié)果

白癜風(fēng)是一種與自身免疫相關(guān)的色素脫失性疾病,其發(fā)病機(jī)制尚未明確,白癜風(fēng)患者血清和組織內(nèi)發(fā)現(xiàn)有大量細(xì)胞因子異常分泌[1-3],如:白細(xì)胞介素(IL)10、IL-13、IL-17A等。自體培養(yǎng)黑素細(xì)胞移植是近幾年來(lái)治療穩(wěn)定期白癜風(fēng)的一種有效的方法,我院[4]采用自體培養(yǎng)的黑素細(xì)胞移植治療了632例患者(最大面積達(dá)640 cm2),總有效率為82.28%,痊愈率為52.85%,但仍有部分患者移植效果不佳,可能與細(xì)胞因子介導(dǎo)的免疫異常有關(guān)[5]。我們從細(xì)胞因子IL-17與Foxp3水平研究其與移植療效的相關(guān)性。

一、資料與方法

1.臨床資料:40例尋常型穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者均來(lái)自本院皮膚科門診。其中男18例,女22例,年齡10～68歲,平均29歲,病程1～30年,平均7.9年,所有患者的診斷與分型均符合文獻(xiàn)[6],且均為尋常型,穩(wěn)定時(shí)間≥6個(gè)月。移植部位位于面頸部21例、軀干部11例、四肢部8例,移植后6個(gè)月觀察療效,我們將復(fù)色面積≥70%定義為移植成功組,將復(fù)色面積≤20%定義為移植失敗組,所有患者均非節(jié)段型白癜風(fēng),無(wú)甲狀腺等其他自身免疫性疾病及嚴(yán)重系統(tǒng)性疾病。本研究通過(guò)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),移植治療的患者均簽署知情同意書。

2.標(biāo)本采集:患者移植當(dāng)日于晨8時(shí)空腹采集外周靜脈血5 ml,靜置1 h后以1 157×g離心,20 min后取上清液裝于微量離心管中,封口儲(chǔ)存在-80℃冰箱內(nèi)備檢。6個(gè)月后,根據(jù)隨訪情況將其納入移植成功組或移植失敗組。

3.自體培養(yǎng)的黑素細(xì)胞移植:將虹膜剪剪下的供皮區(qū)正常皮膚置于無(wú)菌D-Hanks液中,用0.25%胰蛋白酶及0.02% EDTA先后在37℃消化10 min。在立體顯微鏡下刮下角質(zhì)層下及真皮上的細(xì)胞。用D-Hanks液沖洗后以半徑5 cm, 129×g,離心5 min,收集沉淀細(xì)胞重懸浮于黑素細(xì)胞Hul6選擇性培養(yǎng)基(F12基礎(chǔ)培養(yǎng)基,含bFGF、CT、IBMX和胎牛血清)中,并將細(xì)胞團(tuán)吹打成細(xì)胞懸液,調(diào)整細(xì)胞濃度5× 105/ml接種于培養(yǎng)瓶中,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。在第3天加入基因素(100 μg/m1)以去除角質(zhì)形成細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的污染,隔天換液1次。當(dāng)黑素細(xì)胞融合后,用0.05%胰酶-EDTA將黑素細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上消化下來(lái)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)到最優(yōu)接種量[4]時(shí),將黑素細(xì)胞從培養(yǎng)瓶上消化下來(lái),離心收集黑素細(xì)胞懸浮于F12培養(yǎng)基中備用。用CO2激光磨削掉利多卡因局部麻醉后的受皮區(qū),根據(jù)移植白斑區(qū)的面積,按600～1 000個(gè)細(xì)胞/mm2[7]收集黑素細(xì)胞,用巴氏吸管將細(xì)胞懸液均勻地接種在移植區(qū)。無(wú)菌凡士林紗布覆蓋,外敷含F(xiàn)12培養(yǎng)液濕紗布,包扎固定。囑咐患者平臥休息1 h,7～10 d后去除紗布,6個(gè)月后觀察移植療效。

4.檢測(cè)方法:人IL-17試劑盒購(gòu)自美國(guó)RD公司,Foxp3 (Human forhead box P3)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Mybiosource公司,用ELISA法檢測(cè)。操作步驟按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和直線回歸方程式,計(jì)算IL-17、Foxp3濃度。

5.統(tǒng)計(jì)分析:使用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料用±s表示,兩組間樣本均數(shù)比較用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

二、結(jié)果

1.臨床資料比較:移植成功組25例,其中男10例,女15例,平均年齡(28.92±11.25)歲,病程(7.8±7.11)年,白斑穩(wěn)定時(shí)間(14.76±12.04)個(gè)月,移植面積(42.08±34.83)cm2,平均復(fù)色率為88%;移植失敗組15例,其中男8例,女7例,平均年齡(30.33±13.81)歲,病程(8.06±5.92)年,白斑穩(wěn)定時(shí)間(13.33±4.60)個(gè)月,平均移植面積(37.66±20.77),移植成功組與失敗組在性別、年齡、病程、穩(wěn)定時(shí)間及移植面積方面相匹配,具有可比性。

2.白癜風(fēng)患者外周血中IL-7、Foxp3的檢測(cè):移植成功組血清中IL-17(15.29±7.86)ng/L、失敗組(43.88±13.02)ng/L,移植成功組明顯低于移植失敗組,兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。血清中Foxp3的水平,成功組(6.08±2.03)ng/L,失敗組(3.37±1.81)ng/L,移植成功組明顯高于移植失敗組(P＜0.05),兩者之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見(jiàn)表1。

表1 白癜風(fēng)移植成功組與移植失敗組外周血IL-17、Foxp3的檢測(cè)(±s) ng/L

表1 白癜風(fēng)移植成功組與移植失敗組外周血IL-17、Foxp3的檢測(cè)(±s) ng/L

注:兩組比較,P＜0.01

組別 例數(shù) IL-17 Foxp3成功組 25 15.29±7.86 6.08±2.03失敗組 15 43.88±13.02 3.37±1.81 t值 7.70 4.32 P值 0.01 0.01

三、討論

自體黑素細(xì)胞移植是一種治療白癜風(fēng)的有效方法,適用于傳統(tǒng)方法治療無(wú)效的穩(wěn)定期白癜風(fēng)。雖然使用個(gè)體化培養(yǎng)基進(jìn)行自體黑素細(xì)胞培養(yǎng)使移植效果明顯提高[8],但仍有部分患者移植失敗或效果不佳,可能與尋常型穩(wěn)定期白癜風(fēng)患者局部白斑皮膚處于免疫異常狀態(tài)[9]相關(guān)。我們的實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在移植成功與移植失敗的白癜風(fēng)外周血中,移植成功組血清中的IL-17水平明顯低于移植失敗組,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。IL-17被認(rèn)為是Th-17細(xì)胞產(chǎn)生的最主要的細(xì)胞因子,有促炎癥和機(jī)體防御功能[10]。有研究表明,IL-17在白癜風(fēng)患者皮損處組織液中的表達(dá)水平升高[9-10]。Bassiouny等[2]報(bào)道,白癜風(fēng)患者血清及組織中的IL-17水平均較正常對(duì)照組高,說(shuō)明黑素細(xì)胞處于破壞階段。與此同時(shí),我們還發(fā)現(xiàn)在移植成功與移植失敗的白癜風(fēng)外周血中,Foxp3+的水平顯著高于移植失敗組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。

我們的研究表明,移植失敗組血清中的IL-17表達(dá)增高,而Foxp3水平下降,我們推測(cè)移植失敗的原因可能是:一方面Th17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)亢進(jìn),過(guò)度及持續(xù)表達(dá)的IL-17可能通過(guò)刺激炎癥細(xì)胞產(chǎn)生IFN-r,IL-6,IL-8等炎癥因子而對(duì)黑素細(xì)胞產(chǎn)生損傷,從而導(dǎo)致移植部位黑素細(xì)胞的凋亡。另一方面是Treg細(xì)胞免疫抑制功能的降低,Foxp3+水平的降低使Treg細(xì)胞的免疫抑制功能降低,不能抑制自身反應(yīng)性T細(xì)胞的活化,導(dǎo)致自身炎癥反應(yīng)的持續(xù)存在,從而使黑素細(xì)胞受損,導(dǎo)致移植效果不佳。導(dǎo)致IL-17及Foxp3失衡的誘因尚不清楚。由于我們的樣本量較小,還需要更多的研究。

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2013-12-04)

(本文編輯:吳曉初)

Relationship between the efficacy of autologous cultured melanocyte transplantation and serum levels of interleukin-17 and FoxP3 in patients with vitiligo

Li Xiaowen，Lin Fuquan，Zhang Dimin，Hong Weisong，Xu Ai′e.Department of Dermatology，Third People′s Hospital of Hangzhou，Hangzhou 310009，China

Xu Ai′e，Email:xuaiehz@msn.com

ObjectiveTo investigate the relationship between the efficacy of autologous cultured melanocyte transplantation and serum levels of interleukin-17(IL-17)and FoxP3 in patients with vitiligo.MethodsForty patients with stable vitiligo vulgaris were included in this study，and

autologous cultured melanocyte transplantation.Six months after the transplantation，treatment efficacy was evaluated，and patients were classified into the successfully treated group(n=25)and unsuccessfully treated group(n=15).Peripheral blood was collected from all the patients before the transplantation，and enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)was performed to measure the serum levels of IL-17 and FoxP3.Statistical analysis was done using two independent samplest-test with the SPSS software(version 17.0).ResultsThe successfully treated patients showed lower serum levels of IL-17((15.29±7.86)vs.(43.88±13.02)ng/L，P＜0.05)，but higher serum levels of FoxP3 ((6.08±2.03)vs.(3.37±1.81)ng/L，P＜0.05)than the unsuccessfully treated patients.ConclusionThe increased serum IL-17 and decreased serum FoxP3 may contribute to the failure of autologous cultured melanocyte transplantation in patients with vitiligo.

Vitiligo;Interleukin-17;Forhead box P3;Cell transplantation;Transplantation，autologous; Treatment outcome

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.016

國(guó)家自然科學(xué)基金(81071294、81271758);浙江省自然科學(xué)基金(z2100973);省部共建項(xiàng)目(WKJ2012-2-036);杭州市重大科技創(chuàng)新項(xiàng)目(20122513A02)

310009杭州市第三人民醫(yī)院皮膚科

許愛(ài)娥,Email:xuaiehz@msn.com