阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性及c-kit、ERK蛋白表達(dá)的影響

吳艷華 湯楠 蔡蘭花 李其林

阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性及c-kit、ERK蛋白表達(dá)的影響

吳艷華 湯楠 蔡蘭花 李其林

目的探討阿魏酸對(duì)體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性及c-kit、ERK蛋白表達(dá)的影響。方法以不同濃度的阿魏酸干預(yù)體外培養(yǎng)的正常人表皮黑素細(xì)胞,用MTS法分別檢測(cè)培養(yǎng)24、48、72 h后黑素細(xì)胞的增殖活性。用NaOH裂解法檢測(cè)培養(yǎng)72 h后黑素細(xì)胞的黑素合成。用多巴氧化反應(yīng)法測(cè)定培養(yǎng)72 h后黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性。用Western印跡法測(cè)定培養(yǎng)72 h黑素細(xì)胞c-kit蛋白及ERK1/2蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對(duì)照組相比,0.01、0.1、1 mg/ml阿魏酸在作用24、48、72 h后,抑制黑素細(xì)胞增殖作用的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),其中1 mg/ml阿魏酸作用72 h抑制黑素細(xì)胞活性最高。0.01、0.1、1 mg/ml阿魏酸均能顯著影響黑素合成和酪氨酸酶活性,并可降低黑素細(xì)胞中c-kit蛋白及ERK1/2蛋白表達(dá)水平,與對(duì)照組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05)。結(jié)論阿魏酸可抑制培養(yǎng)的人表皮黑素細(xì)胞增殖、黑素合成及酪氨酸酶活性,并可下調(diào)黑素細(xì)胞c-kit蛋白及ERK蛋白的表達(dá)。

阿魏酸;黑素細(xì)胞;細(xì)胞增殖;酪氨酸;原癌基因蛋白質(zhì)c-kit

黃褐斑主要病因可能與紫外線、內(nèi)分泌、遺傳、氧自由基、藥物與化妝品、口服避孕藥、局部微生態(tài)、機(jī)體系統(tǒng)性病變、情緒波動(dòng)等因素有關(guān)[1]。其發(fā)病機(jī)制有多種學(xué)說:①黃褐斑患者皮損區(qū)黑素細(xì)胞的合成功能活躍,基底層黑素顆粒增加,但黑素細(xì)胞卻沒有增殖[2];②黃褐斑皮損區(qū)表皮不僅黑素細(xì)胞數(shù)目增多,同時(shí)伴有基底層黑素細(xì)胞和黑素顆粒增加[3]。阿魏酸(4-羥基-3-甲氧基苯丙烯酸)是當(dāng)歸、川芎、升麻等中藥的有效成分之一,國內(nèi)學(xué)者在當(dāng)歸對(duì)黃褐斑的治療方面進(jìn)行了初步研究,得到了較為積極的結(jié)果[4]。已有研究表明,阿魏酸有抗氧化的作用,可用于皮膚病治療,如黃褐斑等[5]。但阿魏酸治療黃褐斑的具體作用機(jī)制尚未明確,我們旨在研究當(dāng)歸單體阿魏酸對(duì)人表皮黑素細(xì)胞增殖、黑素合成、酪氨酸酶活性及c-kit蛋白、ERK蛋白表達(dá)的影響,探討阿魏酸治療黃褐斑的可能機(jī)制。

材料與方法

一、試劑與材料

黑素細(xì)胞株購于美國Lonza公司,為正常成人表皮黑素細(xì)胞,貨號(hào)CC-2586(NHEM-Ad),生產(chǎn)批號(hào)21793-0127。阿魏酸購于中國食品藥品檢定研究所,以MBM完全培養(yǎng)基配制成100 mg/ml的溶液,置于-20℃的冰箱中保存。臨用前以新鮮MBM完全培養(yǎng)基調(diào)配至實(shí)驗(yàn)所需濃度,根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,設(shè)定阿魏酸實(shí)驗(yàn)終濃度為0.01、0.1、1 mg/ml。

主要試劑:黑素細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)基MBMTM-4(貨號(hào)CC-3250)、黑素細(xì)胞生長添加劑MGMTM-4(貨號(hào)CC-4435)、類皮素-3 Endothelin-3(貨號(hào)CC-4510)、左旋多巴(L-Dopa)、Trypain/EDTA Solution(美國Lonza公司)。MTS、4%甲醛(武漢博士德生物工程有限公司),中性樹膠(上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司), SDS-PAGE凝膠配制試劑盒(碧云天生物技術(shù)研究所),蛋白Marker(美國Thermo公司),Tris(廣州生物科技有限公司),羊抗兔IgG(美國Earthoc公司)。c-kit Rabbit mAb、ERK1/2 Rabbit mAb(美國Cell Signaling公司)。

二、方法

1.黑素細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定:完全黑素細(xì)胞培養(yǎng)基:MBMTM-4、MGMTM-4、Endothelin-3混勻液,置入100 ml的分裝瓶中,放入-4℃的冰箱中保存。正常成人表皮黑素細(xì)胞株接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,生長融合達(dá)70%～80%時(shí)可進(jìn)行傳代培養(yǎng),1∶2傳代,每瓶加入約3～4 ml的完全培養(yǎng)基,移入37℃含CO2濃度為5%的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

L-Dopa染色法鑒定黑素細(xì)胞,取處于對(duì)數(shù)生長期的正常人表皮黑素細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5× 104/ml,接種于已添加相應(yīng)蓋玻片的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng),4%甲醛固定細(xì)胞20～25 min,L-Dopa染色液40 min,每隔30 min觀察黑素細(xì)胞的染色情況,更換染液,約3 h后染液呈棕色,終止染色漂洗蓋玻片2 min,蘇木素復(fù)染細(xì)胞核,梯度酒精逐級(jí)脫水,中性樹膠封片,常溫下晾干,激光共聚焦顯微鏡下觀察黑素細(xì)胞的鑒定情況,拍照。

2.MTS法測(cè)定黑素細(xì)胞增殖:以5×104/ml接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,培養(yǎng)24 h,分別加入不同濃度阿魏酸,設(shè)對(duì)照組(僅黑素細(xì)胞和完全培養(yǎng)基)。每個(gè)濃度設(shè)5個(gè)復(fù)孔,分別培養(yǎng)24、48、72 h,觀察黑素細(xì)胞形態(tài)變化,加入MTS顯色液,每孔20 μl,37℃培養(yǎng)4 h終止培養(yǎng),490 nm波長下檢測(cè)各孔吸光度A值。

3.NaOH裂解法測(cè)定黑素細(xì)胞的黑素合成:預(yù)先用不同濃度阿魏酸溶液培養(yǎng)細(xì)胞72 h。每孔加入100 μl濃度為1 mmol/L的NaOH溶液裂解細(xì)胞, 37℃水浴箱中水浴1 h,酶標(biāo)儀在450 nm波長下測(cè)量各孔吸光度A值。

4.Dopa氧化反應(yīng)法測(cè)定黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性:預(yù)先用不同濃度阿魏酸溶液培養(yǎng)細(xì)胞72 h。每孔加入90 μl濃度為1%的TritonX-100溶液,置入-80℃冰箱中凍存30 min,室溫使細(xì)胞完全裂解,每孔加入10 μl濃度為0.1%的L-Dopa溶液,恒溫37℃,含CO2濃度為5%培養(yǎng)箱中孵育2 h,酶標(biāo)儀在490 nm波長下測(cè)量各孔吸光度A值。

5.Western印跡法測(cè)定黑素細(xì)胞c-kit蛋白及ERK1/2蛋白表達(dá)水平:預(yù)先用不同濃度阿魏酸溶液培養(yǎng)細(xì)胞72 h。根據(jù)RIPA裂解液(強(qiáng))試劑盒說明書提取黑素細(xì)胞蛋白,-80℃低溫冰箱中保存;配好分離膠及濃縮膠,加入蛋白樣品。電泳:濃縮膠用80 V時(shí)間30～40 min、分離膠100 V時(shí)間60～70 min,終止電泳后轉(zhuǎn)膜;封閉及雜交:結(jié)合一抗、二抗?；瘜W(xué)發(fā)光及凝膠圖象分析:采用Super ECL發(fā)光液,采用凝膠圖象處理分析系統(tǒng)(Image Lab)進(jìn)行條帶分析,分析每條條帶的灰度值,同時(shí)計(jì)算每組目的條帶蛋白灰度值與內(nèi)參條帶蛋白灰度比值。

6.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,計(jì)量資料用±s表示,兩個(gè)因素的組間比較采用兩個(gè)因素多個(gè)水平的析因設(shè)計(jì)與方差分析,單個(gè)因素的組間比較采用單因素方差分析(one way-ANOVA),方差齊時(shí)采用 SNK(Student-Newman-Keuls)法進(jìn)行組間兩兩比較;各組方差不齊,則采用Tamhane T2檢驗(yàn)方法,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、正常人表皮黑素細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定

正常人表皮黑素細(xì)胞傳代培養(yǎng)經(jīng)12～24 h后即可貼壁,倒置顯微鏡下可見呈梭形的樹突狀細(xì)胞,樹突形狀細(xì)長。細(xì)胞傳代培養(yǎng)24 h后首次換液。后期每隔2～3天換一次液,倒置顯微鏡下可見黑素細(xì)胞逐漸增殖,樹突數(shù)量逐漸增多至2個(gè)以上,最多者可達(dá)6～7個(gè)樹突。約10～15 d后,黑素細(xì)胞接近融合狀態(tài)(70%～80%),細(xì)胞樹突間交織成網(wǎng)狀,則可進(jìn)行傳代,可見大量的黑素細(xì)胞(圖1)。經(jīng)左旋多巴(L-Dopa)染色后的正常人表皮黑素細(xì)胞,呈陽性反應(yīng),黑素細(xì)胞各細(xì)胞樹突及胞質(zhì)呈黑色或棕褐色(圖2)。

圖1 培養(yǎng)的正常黑素細(xì)胞(×200)

圖2 左旋多巴染色鑒定的黑素細(xì)胞(×200)

二、阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞增殖活性的影響

與對(duì)照組相比,0.01、

0.1、1 mg/ml阿魏酸在作用24、48、72 h后,抑制黑素細(xì)胞增殖作用的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P＜0.05),其中1 mg/ml阿魏酸作用72 h抑制黑素細(xì)胞增殖活性最高。見表1。

表1 阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞增殖的影響(A值,±s)

表1 阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞增殖的影響(A值,±s)

注:與對(duì)照組比較,a:P＜0.05

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三、阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞黑素合成的影響

各組數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析結(jié)果顯示:不同濃度阿魏酸溶液對(duì)黑素細(xì)胞黑素合成的影響不同(F= 36.924,P=0.000),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;即隨著阿魏酸濃度的增大黑素合成逐漸減少,0.01 mg/ml組、0.1 mg/ml組、1 mg/ml組較對(duì)照組,對(duì)黑素合成均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,1 mg/ml組較0.01 mg/ml組對(duì)黑素合成抑制較明顯,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,但0.1 mg/ml組與0.01 mg/ml組、1 mg/ml組比較,對(duì)黑素合成的影響差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表2。

表2 阿魏酸對(duì)黑素合成的影響(±s)

表2 阿魏酸對(duì)黑素合成的影響(±s)

注:與對(duì)照組相比,a:P＜0.05;與0.01 mg/ml組相比,b:P＜0.05

組別 復(fù)孔對(duì)照組 5 0.01 mg/ml組 5 0.1 mg/ml組 5 1 mg/ml組 5 A值0.039±0.006 0.028±0.002a 0.025±0.001a 0.021±0.001ab

四、阿魏酸對(duì)酪氨酸酶活性的影響

各組數(shù)據(jù)經(jīng)方差分析結(jié)果顯示:不同濃度阿魏酸溶液對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響不同(F= 333.017,P=0.000),方差分析差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,即隨著阿魏酸濃度的增大酪氨酸酶活性逐漸減弱, 0.01 mg/ml組、0.1 mg/ml組、1 mg/ml組較對(duì)照組,對(duì)酪氨酸酶活性影響差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,1 mg/ml組較0.01 mg/ml組、0.1 mg/ml組對(duì)酪氨酸酶活性,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

表3 阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響(±s)

表3 阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞酪氨酸酶活性的影響(±s)

注:與對(duì)照組相比,a:P＜0.05;與0.01 mg/ml組相比,b:P＜0.05;與0.1 mg/ml組相比,c:P＜0.05

A值0.162±0.006 0.144±0.003a 0.121±0.002ab 0.095±0.005abc組別 復(fù)孔對(duì)照組 5 0.01 mg/ml組 5 0.1 mg/ml組 5 1 mg/ml組 5

五、阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞c-kit及ERK1/2蛋白表達(dá)水平的影響

與對(duì)照組比較,0.01、0.1、1 mg/ml c-kit蛋白表達(dá)及ERK1/2均有明顯降低(P＜0.05);以1 mg/ml組下降最顯著。見表4,圖3,4。

表4 阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞c-kit及ERK1/2蛋白表達(dá)水平的影響(±s)

表4 阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞c-kit及ERK1/2蛋白表達(dá)水平的影響(±s)

注:與對(duì)照組比較,a:P＜0.05;與0.01mg/ml組比較,b:P＜0.05;與0.1 mg/ml組相比,c:P＜0.05

c-kit ERK1/2 0.46±0.06 1.89±0.12 0.37±0.03a 0.85±0.07a 0.34±0.02ab 0.76±0.08ab 0.18±0.03ab 0.63±0.18abc組別 復(fù)孔對(duì)照組 5 0.01mg/ml組 5 0.1mg/ml組 5 1mg/ml組 5

圖3 阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞c-kit蛋白表達(dá)水平的影響

圖4 阿魏酸對(duì)黑素細(xì)胞ERK1/2蛋白表達(dá)水平的影響

討論

阿魏酸主要有抗氧化[5]、清除氧自由基、有效抑制血小板聚集和血栓形成等方面的藥理活性[6]。Di Domenico等[7]研究表明,阿魏酸的抗氧化作用可保護(hù)色素增多性皮膚病引起的氧化應(yīng)激反應(yīng),同時(shí)對(duì)活性氧的產(chǎn)生、蛋白質(zhì)氧化和脂質(zhì)過氧化也有保護(hù)作用。張延萍等[8]認(rèn)為,阿魏酸不僅能降低酪氨酸酶的單酚酶活力,還能明顯地延長酪氨酸酶反應(yīng)的遲滯時(shí)間,是一種強(qiáng)效的酪氨酸酶抑制劑。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:與對(duì)照組比較,不同濃度組的阿魏酸溶液對(duì)黑素細(xì)胞增殖、黑素細(xì)胞黑素合成、酪氨酸酶活性均有明顯的抑制作用(P＜0.05),結(jié)果提示,阿魏酸可抑制酪氨酸酶活性,抑制黑素合成,這可能是阿魏酸治療黃褐斑有效機(jī)制之一。

黑素細(xì)胞表面具有c-kit受體,c-kit受體即為酪氨酸酶受體。Alexeev等[9]認(rèn)為,c-kit受體在黑素細(xì)胞生理學(xué)中起關(guān)鍵作用,主要影響黑素生成、增殖、遷移和存活的色素生成細(xì)胞。Luo等[10]通過對(duì)野生型小鼠和白斑突變型小鼠的配體和受體分子進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),c-kit受體主要是通過酪氨酸激酶信號(hào)通路的改變與皮膚、毛囊的色素障礙性疾病有關(guān),表明了c-kit對(duì)黑素細(xì)胞的功能起作用。Moss等[11]研究顯示:小鼠和人類的毛發(fā)的色素脫失與c-kit的表達(dá)密切相關(guān),越是色素缺失的皮損處,c-kit受體的表達(dá)越是減少。由此可見,c-kit受體的酪氨酸激酶信號(hào)通路在黑素細(xì)胞的黑素合成和黑素細(xì)胞的存活、遷移中起著重要作用,c-kit表達(dá)的減少導(dǎo)致黑素細(xì)胞的損傷。Goodall等[12]認(rèn)為,可能通過抑制PDGF2β和IL21β等基因表達(dá),抑制ERKl/2活性,后者可能進(jìn)一步影響原癌基因的表達(dá),而原癌基因表達(dá)的減少將直接導(dǎo)致與細(xì)胞增殖有關(guān)的蛋白質(zhì)基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)減少,從而抑制細(xì)胞增殖;同時(shí)通過激活MEK/ERK的信號(hào)通路導(dǎo)致磷酸化MITF在絲氨酸73表達(dá),MITF是眾所周知的通過控制色素沉著的一種黑素生成調(diào)節(jié)酶,導(dǎo)致其降解。Yao等[13]研究認(rèn)為:通過抑制黑素的合成能力,激活ERK途徑,從而抑制酪氨酸酶的活性,減少黑素合成。本研究結(jié)果顯示:不同濃度的阿魏酸溶液對(duì)黑素細(xì)胞的c-kit蛋白及ERK1/2蛋白表達(dá)水平均有下調(diào)作用。由此可見,抑制ERK1/2活性,則可抑制酪氨酸酶活性,使黑素合成減少,從而達(dá)到治療黃褐斑等色素增多性疾病的目地。

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2014-07-04)

(本文編輯:吳曉初)

Effect of ferulic acid on the proliferation of,as well as melanin synthesis,tyrosinase activity and expressions of c-kit and ERK proteins in keratinocytes

Wu Yanhua*，Tang Nan，Cai Lanhua，Li Qilin.*Fourth Affiliated Hospital of Jinan University School of Medicine;Department of Traditional Chinese Medicine，Guangzhou Red Cross Hospital，Guangzhou 510220，China

Wu Yanhua，Email:wuyanhua368@163.com

ObjectiveTo evaluate thein vitroeffect of ferulic acid on the proliferation of，as well as melanin synthesis，tyrosinase activity and expressions of c-kit and ERK proteins in cultured normal human epidermal melanocytes.MethodsCultured normal human epidermal melanocytes were treated with various concentrations of ferulic acid for different durations，and those remaining untreated served as the control.Then，3-(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)-2H-tetrazolium，inner salt(MTS)assay was performed to estimate cell proliferative activity at 24，48 and 72 hours，sodium hydroxide solubilization method to quantify melanin content in melanocytes at 72 hours，dopa oxidation assay to evaluate tyrosinase activity at 72 hours，Western blot to measure the expressions of c-kit and ERK1/2 proteins at 72 hours.ResultsCellular proliferative activity was significantly inhibited in melanocytes treated with ferulic acid of 0.01，0.1 and 1 mg/ml for 24，48 and 72 hours compared with untreated melanocytes(allP＜0.05)，and the 72-hour treatment with ferulic acid of 1 mg/ml showed the strongest inhibitory effect.Ferulic acid at 0.01，0.1 and 1 mg/ml all markedly suppressed melanin synthesis and tyrosinase activity，decreased the expressions of c-kit and ERK1/2 proteins in melanocytes，with significant differences in these parameters between ferulic acid-treated and untreated melanocytes(allP＜0.05).ConclusionsFerulic acid could downregulate the proliferation of，as well as melanin synthesis，tyrosinase activity，and expressions of c-kit and ERK proteins in cultured human epidermal melanocytes.

Ferulic acid;Melanocytes;Cell proliferation;Tyrosine;Proto-oncogene proteins c-kit

10.3760/cma.j.issn.0412-4030.2014.10.014

廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2011B031800034)

510220廣州,暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)院第四附屬醫(yī)院、廣州市紅十字會(huì)醫(yī)院中醫(yī)科(吳艷華、湯楠、蔡蘭花),皮膚科(李其林)

吳艷華,Email:wuyanhua368@163.com