β2腎上腺素能受體基因多態(tài)性與漢族人群早產(chǎn)的相關(guān)性研究

吳 琳，倪穗琴（廣州市第一人民醫(yī)院藥學(xué)部，廣州 510180）

早產(chǎn)是導(dǎo)致新生兒患病和死亡最常見及最主要的原因[1]。早產(chǎn)的發(fā)生，是由遺傳因素和環(huán)境因素等多種因素作用的結(jié)果，具體機(jī)制仍不明。近年來眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)β2腎上腺素能受體（β2-AR）基因存在多態(tài)性，此多態(tài)性可引起β2-AR表達(dá)量及反應(yīng)性的改變，其中編碼第16和27位氨基酸的變異已在體外實驗中證實可以改變β2-AR的功能[2]。β2-AR存在于子宮平滑肌，還分布于支氣管平滑肌、血管平滑肌、胃腸平滑肌等，已有研究證明β2-AR基因多態(tài)性與哮喘、高血壓等疾病具有相關(guān)性，對疾病調(diào)節(jié)起重要作用[3-5]。而β2-AR基因多態(tài)性與早產(chǎn)的相關(guān)性未見報道，是否由于β2-AR的基因多態(tài)引起子宮平滑肌的高反應(yīng)性致使部分患者易發(fā)生早產(chǎn)值得探討。本文將從個體遺傳特征的角度，探討β2-AR基因多態(tài)性在產(chǎn)婦中分布的特征及其對早產(chǎn)的影響。

1 資料與方法

1.1 資料來源

選擇2010年5月－2013年1月在本院分娩的產(chǎn)婦為研究對象，分為研究組及對照組。研究組為早產(chǎn)產(chǎn)婦或在妊娠過程中發(fā)生過先兆早產(chǎn)的產(chǎn)婦，對照組為妊娠期間未曾保胎的足月產(chǎn)婦，所選產(chǎn)婦均為漢族。妊娠滿28周至不足37周出現(xiàn)至少10 min一次的規(guī)律宮縮，伴宮頸管縮短，可診斷為先兆早產(chǎn)；若20 min內(nèi)有4次以上規(guī)律宮縮或60 min內(nèi)有8次以上宮縮，同時伴有宮頸消退75%以上、宮頸進(jìn)行性擴(kuò)張2 cm以上者為早產(chǎn)臨產(chǎn)。在獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)的情況下，將早產(chǎn)產(chǎn)婦或先兆早產(chǎn)的產(chǎn)婦及足月產(chǎn)婦分別納入研究組及對照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)產(chǎn)婦、妊娠合并糖尿病、妊娠期肝內(nèi)膽汁淤積癥、妊娠高血壓疾病、雙胎、前置胎盤、胎膜早破、胎盤早剝以及合并內(nèi)分泌、心、肝、腎等疾病。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本收集。抽取研究組與對照組產(chǎn)婦的肘靜脈血2 ml，置于含乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝的試管中，輕輕搖勻后，分裝至微量離心管（EP管），置于－80℃冰箱保存，備測。

1.2.2 基因組DNA提取。采用TIANamp Blood DNA Kit提取基因組DNA。按照試劑盒說明書提取DNA，所得DNA樣本經(jīng)紫外分光光度儀（Nanodrop 2000）測定核酸濃度后，全部標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量濃度為10 μg/μl，置于－20℃冰箱保存。

1.2.3 引物設(shè)計及合成。引物參照文獻(xiàn)設(shè)計[6]，由上海生物工程技術(shù)有限公司合成。β2-AR基因編碼區(qū)Arg16Gly位點的PCR引物為F1和R1，引物序列為：F1 5′-GCCTTCTTGCTGGC-ACCCCAT-3′；R1 5′-CAGACGCTCGAACTTGGCCATG-3′；編碼區(qū)Gln27Glu位點的PCR引物為F2和R2，引物序列為：F2 5′-CAGCCAGTGCGCTTACCTGC-3′；R2同Arg16Gly位點的PCR引物R1。

1.2.4 β2-AR基因多態(tài)性位點檢測。β2-AR基因編碼區(qū)Arg16Gly位點的PCR引物為F1和R1，各在2個引物3′端的原序列上改動了1個堿基，PCR后分別引入限制性內(nèi)切酶NcoⅠ的酶切位點。當(dāng)緊接著F1引物3′端的核苷酸序列由A變異為G時，即產(chǎn)生了NcoⅠ的切點；R1引物引入的NcoⅠ切點作為酶切的內(nèi)對照。F1/R1的擴(kuò)增片段為168 bp，NcoⅠ酶切后為2個片段的，即只有1個NcoⅠ酶切位點（Arg16），定為AA型；酶切后為3個片段的，定為GG型；雜合狀態(tài)為AG型。編碼區(qū)Gln27Glu位點的PCR引物為F2和R2，擴(kuò)增片段為225 bp。該片段內(nèi)含有2個BbvⅠ切點，27位由谷氨酸替代后，其中1個BbvⅠ酶切位點消失，因此酶切后為3個片段的定為GlnGln型，2個片段為GluGlu型，雜合狀態(tài)為GlnGlu型。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 16.0軟件進(jìn)行分析。用直接計數(shù)法計算基因型和等位基因頻率，應(yīng)用擬合優(yōu)度χ2檢驗兩組中的Hardy-Weinberg平衡，采用χ2檢驗比較各基因型和等位基因頻率分布是否存在差異。

2 結(jié)果

2.1 一般情況

共入選236例產(chǎn)婦，研究組129例中，早產(chǎn)產(chǎn)婦為79例，妊娠過程中發(fā)生過先兆早產(chǎn)的產(chǎn)婦為50例；對照組107例為妊娠期間未曾保胎的足月產(chǎn)婦。研究組平均年齡為（27.91±3.679）歲，對照組平均年齡為（27.46±3.038）歲，兩組年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 β2-AR基因多態(tài)性與早產(chǎn)的關(guān)系

研究組與對照組β2-AR基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律，具有群體代表性，見表1。β2-AR基因編碼區(qū)Arg16Gly位點、Gln27Glu位點基因頻率分布在兩組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），分別見表2和表3。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）方法檢測Arg16Gly和Gln27Glu兩位點的電泳結(jié)果如圖1。

表1 Hardy-Weinberg平衡檢驗Tab 1 Hardy-Weinberg equilibrium test

表2 β2-AR基因編碼區(qū)Arg16Gly位點基因型和等位基因頻率Tab 2 The frequencies of Arg16Gly genotype and allele of β 2-adrenergic receptor

3 討論

β2-AR由定位于染色體5q31-32的人β2-AR基因編碼，在編碼區(qū)存在9個堿基突變點，其中常見的突變位點為46、79位堿基突變，導(dǎo)致β2-AR基因編碼的第16、27位氨基酸發(fā)生改變，即基因第46位堿基突變（由A突變?yōu)镚）致第16位氨基酸精氨酸（Arg）變?yōu)楦拾彼幔℅ly），基因第79位堿基突變（由C突變?yōu)镚）致第27位氨基酸谷氨酰胺（Gln）變?yōu)楣劝彼幔℅lu）。β2-AR基因突變可導(dǎo)致受體表達(dá)改變，第16位氨基酸的變異點已在體外實驗中證實可以改變β2-AR的功能[2]。

表3 β2-AR基因編碼區(qū)Gln27Glu位點基因型和等位基因頻率Tab 3 The frequencies of Gln27Glu genotype and allele of β2-adrenergic receptor

β2-AR基因多態(tài)性與疾病的易感性是國內(nèi)外研究的熱點，已有研究證明β2-AR基因多態(tài)性與哮喘[7]、高血壓[8-9]等疾病具有相關(guān)性。邱玉英等[10]對201例哮喘患者的研究顯示，攜帶Arg16Arg基因型的患者支氣管擴(kuò)張反應(yīng)高于攜帶Arg16Gly基因型和Gly16Gly基因型的患者；馮端興等[11]的研究顯示，具有β2-AR16位點基因多態(tài)性與哮喘關(guān)聯(lián)；Lou Y等[12]對我國北方漢族高血壓患者747例和正常血壓者390例進(jìn)行相關(guān)性分析時發(fā)現(xiàn)，高血壓組Arg16Gly多態(tài)G等位基因頻率（48.3%）明顯高于正常血壓者（35.4%）。

β2-AR分布于子宮、血管、支氣管、肝臟，子宮肌細(xì)胞膜上的β2-AR興奮后，激活細(xì)胞膜的腺苷酸環(huán)化酶，使三磷酸腺苷轉(zhuǎn)化為環(huán)磷酸腺苷，從而降低肌漿蛋白輕鏈激酶的活性，并使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度降低，使肌肉的收縮蛋白不能作用而抑制宮縮；同時，血管平滑肌松弛，胎盤血流量增加，致血壓降低、脈壓增大，改善宮內(nèi)供氧環(huán)境[13]。本研究從個體遺傳特征的角度，探討了β2-AR基因多態(tài)性在產(chǎn)婦中分布的特征及其對早產(chǎn)的影響，結(jié)果表明β2受體編碼第16、27位點氨基酸的基因多態(tài)性與早產(chǎn)的發(fā)生無相關(guān)性，提示該多態(tài)位點并不是引起早產(chǎn)的獨立危險因素。在試驗中未檢出UU基因型，針對該問題研究組成員[14]曾做過腎上腺素能受體基因多態(tài)性和中國人支氣管哮喘關(guān)系的Meta分析，發(fā)現(xiàn)UU基因型的檢出率也是極低的，檢出率范圍為0～8%。本研究不足之處在于入選的樣本量較少，有待擴(kuò)大樣本量分析。

基因多態(tài)性不僅引起受體功能的改變和疾病的發(fā)生，而且在一定程度上影響對治療的反應(yīng)[15]。Martinez FD等[6]對具有特定基因型的269名西班牙裔或白人兒童進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)Arg16純合子的兒童在給予沙丁胺醇治療時，其產(chǎn)生的效應(yīng)比Gly16純合子的兒童高5.3倍左右。在早產(chǎn)的治療過程中，抑制子宮收縮是關(guān)鍵，激動子宮平滑肌細(xì)胞上的β2受體可使子宮平滑肌松弛，抑制子宮不正常收縮。其中β2受體激動藥是抑制子宮收縮防治早產(chǎn)最為有效的藥物之一，此類藥物主要包括羥芐羥麻黃堿、沙丁胺醇、特布他林等。陳焱等[16]在觀察羥芐羥麻黃堿防治早產(chǎn)的臨床療效過程中，指出羥芐羥麻黃堿對部分早產(chǎn)患者的臨床療效不佳（4 h內(nèi)顯效者占71.43%），而且臨床療效和副反應(yīng)有較大的個體差異，那么這種現(xiàn)象與β2-AR基因多態(tài)性影響β2受體激動藥療效是否有關(guān)，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)的研究報道，有待進(jìn)一步研究。

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