核桃楸皮化學(xué)成分的鑒定及其抗肝癌活性成分篩選

曹治家，蔡小燕，方 薇，陳洪升，張懷念，張詠莉

(廣東藥學(xué)院，廣州510006)

核桃楸皮是胡桃科胡桃屬落葉喬木核桃楸的干燥樹皮，其味微苦、澀，性寒，具有清熱燥濕、瀉肝明目的功效，主治濕熱下痢、目赤腫痛、麥粒腫、迎風(fēng)流淚、骨結(jié)核等。研究證實(shí)，核桃楸皮的水提物、乙醚提取物及甲醇提取物等都有抗腫瘤的功效［1～3］。現(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，核桃楸皮含有醌類、黃酮類、萜類、多酚類等多種化學(xué)成分［4，5］，但對其所含化學(xué)成分的抗肝癌活性研究較少。2012年12月，本課題組鑒定了核桃楸皮的化學(xué)成分，并對其進(jìn)行抗肝癌活性成分篩選。

1 材料與方法

1.1 材料 核桃楸皮，購自黑龍江省伊里嘎山，經(jīng)鑒定為野生核桃楸樹皮(鑒定單位:黑龍江省藥材公司);人肝癌細(xì)胞株HepG2和人肝組織細(xì)胞LO2由中山大學(xué)臨床藥理研究所黃民教授課題組惠贈。RY2型熔點(diǎn)儀，天津分析儀器廠;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠;層析柱，廣州文?？茖W(xué)儀器有限公司;Bruker DRX600型核磁共振儀，瑞士Bruker公司;LG10-2.4離心機(jī)，北京醫(yī)用離心機(jī)廠;Waters510泵-996PDA高效液相色譜儀、Diamonsil C18(5×250 mm)色譜柱，Dikma公司;CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，日本SANYO SHEL LAB;酶標(biāo)儀，美國BIO-RAD。DMEM高糖培養(yǎng)基、胰蛋白酶、胎牛血清，美國Gibco公司;噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)，美國Sigma公司;甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯、氯仿、正丁醇等，天津市福晨化學(xué)試劑廠;硅膠H(200～300目)、薄層層析硅膠，煙臺市芝罘黃務(wù)硅膠開發(fā)試驗廠。

1.2 方法

1.2.1 核桃楸皮化學(xué)成分的提取、分離及鑒定①乙醇回流提取:取干燥核桃楸皮，粉碎后過20目篩，取粗粉6.0 kg，加入75%乙醇，反復(fù)回流提取3次，每次約1.5 h。合并提取液，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮提取液得到260 g浸膏。②分級萃取:將浸膏用5倍量的熱水溶解，依次用乙酸乙酯、氯仿萃取，各5次，合并乙酸乙酯、氯仿萃取液，65℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮蒸餾至干粉狀，得到乙酸乙酯、氯仿提取物。③硅膠柱層析:取200～300目硅膠400 g，用氯仿1.5 L浸泡，攪拌除去氣泡，濕法裝柱，勿使柱內(nèi)有氣泡，充分靜置30 min以上。取乙酸乙酯和氯仿提取物20 g加入100 mL甲醇溶解，在研缽中與40 g硅膠研磨均勻，50℃干燥，干法上樣。以不同梯度石油醚∶乙酸乙酯(40∶1、30∶1、20∶1、10∶1)流動洗脫，得到各組流份;合并含相同組分的流份，再以不同梯度石油醚∶乙酸乙酯(30∶1、20∶1、10∶1)流動洗脫，得到各組流份。合并含相同組分的流份進(jìn)行鑒定。④單體成分鑒定:采用制備型高效液相色譜儀，在下列條件下:色譜柱:C18反向色譜柱(XTerra?PrepRP 185 μm 19 ×150 mm);流動相:甲醇∶水(10∶90);流速8 mL/min;檢測波長:218 nm;柱溫:25℃;采集時間:30 min;進(jìn)樣量:50 μL;全程He氣脫氣，分離純化各個單體組分;用核磁共振儀進(jìn)行1H-NMR、13CNMR分析，以四甲基硅烷為內(nèi)標(biāo)，DMSO-D6做溶劑，采用標(biāo)準(zhǔn)脈沖程序進(jìn)行實(shí)驗。

1.2.2 體外抗肝癌活性成分篩選［6～8］①細(xì)胞培養(yǎng):在5%CO2、37℃條件下，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝組織細(xì)胞LO2，用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞HepG2，2 d傳代或換液1次，取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗。②體外抗肝癌活性成分篩選:取對數(shù)生長期的HepG2細(xì)胞和LO2細(xì)胞，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度為5×104/mL，接種于96孔培養(yǎng)板，每孔100 μL。培養(yǎng)過夜后，陰性對照組加入100 μL培養(yǎng)基，給藥組分別加入終濃度為10、20、40、80、160 μmol/L 的木犀草素及12.5、25、50、100、200 μmol/L 的刺芒柄花素，陽性對照組加入終濃度9.00 μmol/L的5-氟尿嘧啶(5-Fu)，另設(shè)調(diào)零組(不加細(xì)胞及藥物)，每組設(shè)5個復(fù)孔;培養(yǎng)48 h后，棄去含藥培養(yǎng)基，每孔加入100 μL無血清培養(yǎng)基及15 μL MTT(5 mg/mL)。在 5%CO2、37 ℃條件下培養(yǎng)4 h后，吸去培養(yǎng)基和MTT，每孔加入150 μL DMSO，在低速搖床上震蕩10 min，在酶標(biāo)儀上490 nm波長處測定各組吸光度(A值)，并計算細(xì)胞的存活率及IC50。細(xì)胞存活率(%)=(給藥組A值-調(diào)零組A值)/(陰性對照組A值-調(diào)零組A值)×100%，A值為每組各復(fù)孔的均值。

1.2.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件，計量資料以±s表示，組間比較采用Student-t檢驗。P≤0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 核桃楸皮提取物分離及鑒定 核桃楸皮經(jīng)乙醇回流提取，乙酸乙酯和氯仿萃取，不同梯度石油醚∶乙酸乙酯流動洗脫后，收集到多個色帶組分。將各色帶組分采用制備型高效液相色譜儀分離純化，得到其中的2種化合物，經(jīng)后續(xù)的鑒定工作證實(shí)為2種黃酮類化合物:木犀草素和刺芒柄花素［9，10］。

2.2 體外抗肝癌活性成分篩選 經(jīng)48 h處理后，木犀草素對肝癌細(xì)胞HepG2的IC50達(dá)到(103.32±21.34)μmol/L，對肝組織細(xì)胞 LO2 的 IC50達(dá)到(131.13 ±13.48)μmol/L;刺芒柄花素對 HepG2 細(xì)胞的IC50＞200 μmol/L，說明其對HepG2細(xì)胞的毒性作用較小。兩種化合物的抗肝癌活性見表1、2。

表1 木犀草素對肝癌細(xì)胞HepG2和肝組織細(xì)胞LO2存活率的影響(%，±s)

表1 木犀草素對肝癌細(xì)胞HepG2和肝組織細(xì)胞LO2存活率的影響(%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

組別 n 細(xì)胞存活率HepG2 LO2對照組5 100.00 ±1.86 100.00 ±1.39陽性對照組 5 53.15±0.58＊＊ 39.31±2.70＊＊給藥組10 μmol/L 5 87.94 ±2.62＊＊ 94.08 ±1.11*20 μmol/L 5 71.01 ±6.34＊＊ 86.04 ±1.04＊＊40 μmol/L 5 62.97 ±4.55＊＊ 75.44 ±1.28＊＊80 μmol/L 5 55.23 ±1.73＊＊ 67.98 ±0.66＊＊160 μmol/L 5 43.67 ±1.27＊＊ 40.00 ±2.81＊＊

3 討論

黃酮類化合物是一種存在于自然界的、具有2-苯基色原酮結(jié)構(gòu)的化合物。研究發(fā)現(xiàn)，黃酮類化合物具有抗細(xì)菌、抗病毒、抗腫瘤、抗氧化自由基、抗炎等活性，是目前學(xué)者研究的熱點(diǎn)。本研究中，從核桃楸皮中分離得到2種黃酮類化合物——木犀草素和刺芒柄花素。黃酮類化合物用水作溶劑提取時，提取物所含雜質(zhì)較多且不易純化;用乙醇作溶劑時，提取物中黃酮含量較高。黃酮類化合物是一類熱敏性物質(zhì)，提取分離時溫度應(yīng)控制在65℃以下，否則提取率下降［11，12］。故本研究采用75%乙醇作溶劑回流提取核桃楸皮，并且在旋轉(zhuǎn)濃縮、干燥等環(huán)節(jié)將溫度控制在65℃以下，首次從核桃楸皮中獲得了木犀草素和刺芒柄花素2種黃酮類化合物。

表2 刺芒柄花素對肝癌細(xì)胞HepG2存活率影響(%，±s)

表2 刺芒柄花素對肝癌細(xì)胞HepG2存活率影響(%，±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05

組別 n HepG2細(xì)胞存活率對照組100.00 ±1.43給藥組12.5 μmol/L 5 96.58 ±0.55 25 μmol/L 5 88.14 ±4.63*50 μmol/L 5 81.27 ±9.01*100 μmol/L 5 82.59 ±3.81*200 μmol/L 5 79.75 ±0.46 5*

近年研究發(fā)現(xiàn)，核桃楸皮水煎劑具有明顯的抑制腫瘤作用［13］，其提取物核桃醌等可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡發(fā)揮抗腫瘤作用［14，15］。本研究結(jié)果表明，木犀草素具有較明顯的抑制肝癌細(xì)胞增殖的作用，且呈一定的劑量—效應(yīng)關(guān)系;對正常肝細(xì)胞增殖也有一定的抑制作用;對比木犀草素對肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的增殖抑制作用可發(fā)現(xiàn)，木犀草素對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用較大，說明木犀草素對肝癌細(xì)胞的毒性作用較正常細(xì)胞大。陽性藥物5-Fu在相同劑量時對正常肝細(xì)胞增殖的抑制作用較對肝癌細(xì)胞強(qiáng)，說明5-Fu對正常肝細(xì)胞的毒性作用更大，毒副作用更強(qiáng)。比較陽性藥物5-Fu與木犀草素對肝癌細(xì)胞和正常肝細(xì)胞的毒性可發(fā)現(xiàn)，木犀草素對2種細(xì)胞的毒性均較5-Fu小，且木犀草素對正常肝細(xì)胞的毒性小于肝癌細(xì)胞。因此認(rèn)為，與傳統(tǒng)抗腫瘤藥物5-Fu相比，木犀草素在體外抗肝癌活性具有毒性小、安全性高的優(yōu)勢。同時有文獻(xiàn)報道稱，木犀草素可以呈劑量和時間依賴性地誘導(dǎo)乳腺癌、肺癌等癌細(xì)胞凋亡［16，17］，發(fā)揮抗腫瘤作用，說明木犀草素在抗腫瘤方面具有一定的效果，可以作為抗腫瘤候選藥物進(jìn)一步的研究開發(fā)。體外抗肝癌活性篩選結(jié)果表明，提取物刺芒柄花素對肝癌細(xì)胞有一定的增殖抑制作用，且其增殖抑制作用呈一定的劑量—效應(yīng)關(guān)系，但刺芒柄花素對肝癌細(xì)胞的增殖抑制作用較木犀草素小，細(xì)胞毒性也較木犀草素小。盡管有報道稱，刺芒柄花素可抑制胰島素瘤細(xì)胞和乳腺癌細(xì)胞生長并誘導(dǎo)其凋亡［18，19］，但關(guān)于刺芒柄花素對肝癌細(xì)胞的毒性作用情況并沒有確切的報道，我們的研究也對此進(jìn)行了確認(rèn)和說明。因此，本課題組在下一步的抗肝癌研究中將關(guān)注重點(diǎn)集中在木犀草素上。

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